平成14年度 研究成果

4. 第4四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 Structural features of the glycogen branching enzyme encoding genes from aspergilli

著者
Prasetyawan Sasangka, Aya Matsumoto, Akimitsu Tanaka, Yuki Akasaka, Sachie Suyama, Sumie Kano, Makiko Miyazaki, Takeshi Akao, Masashi Kato, Tetsuo Kobayashi, Norihiro Tsukagoshi
要約

A maltose binding protein, p78, was purified to homogeneity from Aspergillus nidulans by a single column chromatography step on cross-linked amylose. The partial amino acid sequence was highly homologous to the glycogen branching enzymes (GBEs) of human and yeast, and p78 did show branching enzyme activity. The genomic gene and its cDNA encoding GBE (p78) were isolated from the A. nidulans genomic and cDNA libraries. Furthermore, a cDNA encoding A. oryzae GBE was entirely sequenced. A. nidulans GBE shared overall and significant amino acid sequence identity with GBEs from A. oryzae (83.9%), Saccharomyces cerevisiae (61.1%) and human (63.0%), and with starch branching enzymes from green plants (55-56%).

掲載雑誌
Microbiol. Res. 157, 337-344, 2002

2 YM-202204, a New Antifungal Antibiotic Produced by Marine Fungus Phoma sp. 海洋性真菌 Phoma sp.の生産する新規抗真菌抗生物質 YM-202204

著者
Koji Nagai, Kazuma Kamigiri, Hisao Matsumoto, Yasuhiro Kawano, Masakazu Yamaoka, Hitoshi Shimoi, Masato Watanabe, Kenichi Suzuki
永井浩二、上桐和磨、松本久夫、河野泰広、山岡正和、下飯 仁、渡邊正人、鈴木賢一
要約

A new antifungal antibiotic, YM-202204(1), was found in the culture broth of marine fungus Phoma sp. Q60596. The structure of 1 was determined by several spectroscopic experiments as a new lactone compound. This antibiotic exhibited potent antifungal activities against Candida albicans, Cryptococcus neoformans and Aspergillus fumigatus, and also inhibited glycosyl-phosphatidyl- inositol (GPI)-anchoring in yeast cells.

新規抗真菌抗生物質 YM-202204が海洋性真菌 Phoma sp.の培養液中より発見 された。YM-202204の化学構造は、各種機器分析によりラクトン骨格を有する新規化合物と決定された。本化合物は、Candida albicans, Cryptococcus neoforman及びAspergillus fumigatusに対して強力な抗真菌活性を示すとともに、酵母細胞のGPIアンカーの機能を阻害した。

掲載雑誌
J. Antibiotics. 55, 1036-1041, 2002

3 焼酎蒸留粕(廃液)を利用した新素材転換システムに関する基礎研究 -がん細胞増殖抑制効果-

著者
廣瀬茂、田上修、家藤治幸、松本陽子、上岡龍一
要約

焼酎蒸留粕の有効利用法の開発を目的とし、種々の培養がん細胞に対するin vitro での細胞増殖抑制効果、および正常ラットに対する急性毒性試験について検討した。焼酎蒸留粕を種々の培養がん細胞に添加したところ、ヒト胃がん(GT3TKB)細胞に対して顕著な抑制効果が得られた。さらに、正常ラットに対しては、無毒性で安全であることをが明らかになった。焼酎蒸留粕の成分分析からは、糖成分の存在が示唆された。以上のことから、焼酎蒸留粕が医薬組成物又は、健康食品として有効利用できるという可能性が示唆された。

掲載雑誌
化学工学論文集, 28(5), 621-625, 2002

4 dffA Gene from Aspergillus oryzae Encodes L-ornithine N5-oxygenase and Is Indispensable for Deferriferrichrysin Biosynthesis 黄麹菌(Aspergillus oryzae)のdffA遺伝子は、L-ornithine N5-oxygenaseをコードしデフェリフェリクリシン生合成に必須である

著者
Osamu Yamada, Suthamas Na Nan, Takeshi Akao, Mihoko Tominaga, Hisayuki Watanabe, Toshitsugu Satoh, Hitoshi Enei, Osamu Akita
山田修、Suthamas Na Nan、赤尾建、渡辺久敬、佐藤利次、江井仁、秋田修
要約

We identified and analyzed the dffA gene from Aspergillus oryzae which encodes L-ornithine N5-oxygenase involved in the biosynthesis of deferriferrichrysin, a type of siderophore which is a low-molecular-weight iron chelating compound. From among more than 20,000 clones in an A. oryzae EST (Expressed Sequence Tag) library, we found only one clone encoding a protein that exhibited homology to the Ustilago maydis sid1 protein (Sid1) and Pseudomonas aeruginosa pvdA protein (PvdA), both known as the only examples of L-ornithine N5-oxygenase. The complete gene sequence shows that the dffA gene includes a 1575-bp open reading frame (ORF), one 66-bp intron, which is a typical intorn length in A. oryzae, and encodes 502 amino acids with putative FAD-binding, NADP-binding, and 'FATGY' motifs, which are conserved in N-hydroxylating enzymes. As well as that of the U. maydis sid1 gene, dffA gene expression was induced under iron-limited conditions, and the promoter region has several GATA-type transcription regulator binding motifs. When the dffA gene was expressed under the control of the α-amylase promoter in A. oryzae, transformants revealed inducible high L-ornithine N5-oxygenase activities. In addition, a dffA gene disruptant showed no deferriferrichrysin production even under iron-limited conditions. These results clearly suggest that the dffA gene is indispensable for deferriferrichrysin biosynthesis in A. oryzae.

麹菌より鉄キレート物質であるシデロフォアの1種、デフェリフェリクリシン生合成に関与するL-ornithine N5-oxygenase酵素遺伝子dffAをクローニングし解析した。2万以上の麹菌ESTライブラリよりUstilago maydis sid1及びPseudomonas aeruginosa pvdA タンパク質と相同性を有するクローンがただ一つだけ得られた。dffA遺伝子は長さ66-bpのイントロンを一つ含む1575-bpのORFよりなり、502アミノ酸のタンパク質をコードしていた。また、N-ヒドロキシル化酵素に共通するFAD結合、NADP結合及びFATGYモチーフが保存されていた。本dffA遺伝子は、U. maydis同様、鉄欠乏時に発現が誘導され、遺伝子プロモーター内には複数のGATAタイプ転写制御因子の結合部位が存在していた。本遺伝子を麹菌内で強制的に発現させたところ、菌体内L-ornithine N5-oxygenase活性の上昇が見られ、さらにdffA遺伝子破壊株では、デフェリフェリクリシンの合成が見られなかったことから、本遺伝子がデフェリフェリクリシン生合成に必須であることが明らかとなった。

掲載雑誌
J. of Biosci. and Bioengi., 95(1), 82-88, 2003

5 Purification and Characterization of Rice α-Glucosidase, a Key Enzyme for Alcohol Fermentation of Rice Polish 糠酒の発酵におけるキー酵素、米α-グルコシダーゼの精製

著者
Hiroshi Iwata, Toshiaki Suzuki, Isao Aramaki
岩田博、鈴木利明、荒巻功
要約

α-Glucosidase, a key enzyme for nuka-sake brewing, was purified from Oryza sativa cv. Yamadanishiki, which is widely used for sake brewing. The molecular weight of the purified enzyme was 95 kDa. The optimum pH and temperature were 4.5 and 55 ℃, respectively. The substrate specificity differed from that of Oryza sativa cv. Shinsetsu, which is a variety of rice consumed as a cereal. The extraction of α-glucosidase from the rice was stimulated by lactic acid, which suggests that lactic acid plays an important role not only in preventing bacterial contamination, but also in stimulating the parallel fermentation that occurs in nuka-sake brewing.

糠酒発酵においてキー酵素となるα-グルコシダーゼを、酒米の山田錦から精製した。分子量は、95kDa、最適pH、最適温度は、それぞれ4.5,55℃であった。山田錦から精製されたα-グルコシダーゼは、基質特異性において、一般米のシンセツから精製されたα-グルコシダーゼとやや異なるところがあった。α-グルコシダーゼの米からの溶出は、乳酸によって促進されることが分かり、糠酒発酵において、乳酸は、微生物汚染を防ぐばかりか、発酵を促進する作用のあることも分かった。

掲載雑誌
J. of Biosci. and Bioengi., 95 (1), 106-108, 2003

6 赤ワイン醸造における低温醸し(Prefermentation Cold Soak)のアントシアニン色素抽出効果

著者
大久保圭祐、後藤(山本)奈美、岡崎直人
要約

赤ワイン醸造における低温醸し法が色素やフェノール化合物の抽出に及ぼす影響を検討した。カベルネ・ソ?ビニヨン及びメルローの小仕込み試験で、10℃、2日間の低温醸しを行ったものは、低温醸しを行わない対照よりも高いA520(赤色)、A420(黄色)及びA520 at pH 0.25(アントシアニン濃度)を示した。しかし、A280(フェノール化合物濃度の指標)には両者に有意な差がなかった。微生物の影響を排除するため、シクロヘキシミド10mg/l、クロラムフェニコール500mg/l、ピロ亜硫酸カリウム200mg/lを破砕したブドウに添加して非発酵系試験を行った。2日間の低温醸しの後に、5または10%のエタノールを添加して25℃で6日間、非発酵条件で醸した場合は、低温醸しを行わない対照や、エタノールを加えた状態で低温醸しを行った場合よりもA520、A420、アントシアニン濃度が高くなった。また、A280には低温醸しの有無や、低温醸し中のエタノールの有無によって有意な差がなかった。従って、破砕したブドウを1、2日間、エタノール非存在下に保つことで、発酵中に過剰なフェノール化合物の抽出を伴わず、色素の抽出が促進されることが示唆された。

掲載雑誌
醸協, 98(3), 193-200, 2003

(2) 公開特許

1 麹菌の固体培養発現遺伝子を制御する転写因子をコードするDNA

出願番号
特許出願2001-190356
出願日
2001年6月22日
公開番号
特許公開2003-240
公開日
2003年1月7日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、月桂冠株式会社
発明者
石田博樹、秦洋二、川戸章嗣、赤尾健
解決手段

麹菌の固体培養発現遺伝子を制御する転写因子(sgbR1、sgbR2、sgbR3)をコードする遺伝子のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。

効果

固体培養での異種タンパク質の効率的生産が可能となるだけでなく、麹菌の液体培養及び固体培養での酵素生産の包括的改善を行うことが可能となる。

2 酒造原料米の精米歩合及び/又は酒造適性の推定方法

出願番号
特許出願2001-284847
出願日
2001年9月19日
公開番号
特許公開2003-88766
公開日
2003年3月25日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所
発明者
佐藤和夫、小林健
課題

酒造原料米の精米途中の砕米率及び真精米歩合を測定し、精米操作の適否や精米機の稼動状態をリモートで判断するすることを可能とする。

解決手段

酒造原料米について精米時の音響パワーのスペクトル分析を行い、精米歩合及び醸造適性と相関の高い周波数を同定し、この結果に基づいて精米歩合の推定と精米機の制御を行う。酒造原料米以外の米及びその他の穀類についても同様である。

効果

精米操作を中断することなく酒造原料米の精米歩合を推定することができる。また真精米歩合や砕米率など従来測定が困難であった醸造適性のリアルタイム分析ができる。酒造原料米以外の米及びその他の穀類についても同様の効果が奏される。

2003/4/10 掲載

3. 第3四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 音響計測による精米歩合の推定

著者
佐藤和夫、小林健
要約

人間の耳による米の音を判別した結果,玄米と70%精白米の判別が可能であった。この結果は音響パワースペクトル解析によって裏付けることができた。また白米をステンレス板と杉板と衝突させたとき,精米歩合の変化とともに音圧レベルが変化するいくつかの周波数が見出された。テストミルによる精米では精米音のパワースペクトルから精米歩合と相関の高い音圧レベル変化を示す周波数を抽出して回帰式を作成すると精度よく精米歩合を推定することができた。さらにモデル砕米を用いた精米試験において精米音のパワースペクトル解析により砕米率を推定することができた。

掲載雑誌
醸協, 97, 791-797, 2002

2 小型精米機の精米音の解析

著者
佐藤和夫、能勢隆、小林健
要約

小型精米機の精米音パワースペクトルにより特定の波長の音圧レベルから精米歩合を精度良く推定することができた。また精米歩合ごとの音響パワースペク トルデータの主成分分析による主成分スコア・プロットを行った結果、精米歩合70%を境として2つのグループが形成された。これは精米速度の急激な変化に 対応するもので,特定周波数域の音圧レベルが米粒表層の物理的性質の変化に対応した結果と考えられた。

掲載雑誌
醸協, 97, 872-877, 2002

3 Recent Studies of Protein Secretion by Filamentous Fungi(Review) 糸状菌タンパク質分泌生産についての最近の研究(総説)

著者
K. Iwashita
岩下和裕
要約

Filamentous fungi have been widely exploited for the homologous and heterologous protein production because of the high capacity of their protein secretion machinery. However, the production of heterologous proteins is often limited while the production of homologous proteins can be very high. Various researches have reported the methods for overcoming this problem and some techniques, such as the fusion gene system, improve the production of heterologous proteins. The molecular biological study of solid-state culture attracts the attention because the long history of biological studies has shown that the productivity of protein in the solid-state culture frequently exceeds the productivity of protein in the submerged culture. The recent researches of solid-state culture have revealed the new aspects of protein production in filamentous fungi. Solid-state specific gene expression was observed in the glaB and pepA genes of Aspregillus oryzae. A GC-box and HSE element of the glaB promoter region affected solid-state specific gene expression of this gene. Solid-state culture-specific release of enzymes from the cell wall was also observed in the production s-glucosidases in Aspergillus kawachii. Extracellular soluble polysaccharide (ESP) from A. kawachii was concerned with the location of s-glucosidases. Moreover, ESP and the cell wall fraction of A. kawachii were shown to be involved in the stability of s-glucosidases. The knowledge of the molecular biology of solid-state culture should provide new approaches for the production of both homologous and heterologous proteins in both submerged culture and solid-state culture of filamentous fungi.

糸状菌は非常に高いタンパク質分泌生産能を有していることから、ホモローガス、ヘテロローガスなタンパク質の生産に幅広く利用されている。しかし、多くの場合、ヘテロローガスなタンパク質の生産は、ホモローガスなタンパク質の生産に比較して非常に低い。この問題を解決するため様々な試みがなされ、高分泌されるタンパク質との融合遺伝子システム等の方法により分泌生産量の改善が見られている。長い研究の歴史から、糸状菌は固体培養を行うことで、液体培養に比べて非常に多量のタンパク質を生産する事が知られており、近年、固体培養についての分子生物学的な研究が注目を集めている。実際に、近年の固体培養の研究は、様々な新しい知見を提供している。黄麹菌(Aspergillus oryzae)のglaBpepA遺伝子では固体培養環境下で特異的な発現が見られている。固体培養特異的なglaB遺伝子の発現には GC-boxおよびHSEエレメントが関与している事が明らかとなっている。また、白麹菌(Aspergillus kawachii)のβ-グルコシダーゼは、液体培養では細胞壁に局在するが、固体培養環境下では培地中に放出される事が明らかとなっている。このβ-グルコシダーゼの培地中への放出には、可溶性多糖(ESP)が関与していると考えられる。さらに、このESPと白麹菌の細胞壁はβ-グルコシダーゼを安定化させる。これらの知見を含め、固体培養についての分子生物学的研究は、糸状菌のタンパク質分泌生産により一層大きな影響を及ぼすものと期待されている。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering, 94(6), 530-535, 2002

4 Purification and characterization of beta-1,6-glucanase of Streptomyces rochei application in the study of yeast cell wall proteins. 酵母細胞壁タンパク質の解析に有用なStreptomyces rocheiのβ-1,6-グルカナーゼの精製と性質

著者
Wu H, Shimoi H, Ito K.
呉洪、下飯仁、伊藤清
要約

A beta-1,6-glucanase was purified to apparent homogeneity from a commercial yeast digestive enzyme prepared from Streptomyces rochei by a series of column chromatographies. The molecular mass of the purified enzyme was 60 kDa by SDS-PAGE. The purified enzyme had an optimum pH range from 4.0 to 6.0 and was stable in the same pH range. The enzyme was stable under 50 degrees C but lost almost all activity at 60 degrees C. The enzyme was specific to beta-1,6-glucan and had little activity towards beta-1,3-glucan and beta-1,4-glucan. When the beta-1,6-glucan was hydrolyzed with the purified enzyme for 5 h, the reaction products contained 20% glucose, 36% gentiobiose, and 44% other oligosaccharides, suggesting that the enzyme is an endo-type glucanase. When the purified enzyme was used for the digestion of the cell wall of Saccharomyces cerevisiae, cell-wall proteins covalently bound to the cell-wall glucan were recovered as soluble forms, suggesting that this enzyme is useful for analysis of yeast-cell wall proteins.

一連のカラムクロマトグラフィーを用いて、Streptomyces rocheiより製造した市販酵母消化酵素から、見かけ上均一なβ-1,6-glucanaseを精製した。SDS-PAGEにおける精製酵素の分子量は60 kDaであった。精製酵素の至適pHはpH4.0~6.0であり、同じpH範囲で精製酵素は安定であった。また、この酵素は50℃以下では安定であったが、60℃ではほぼ完全に失活した。精製酵素はβ-1,6-glucanに特異的に作用し、β-1,3-glucan、β-1,4-glucanに対してはほとんど作用しなかった。β-1,6-glucanの5時間加水分解産物は、20%のグルコース、36%のgentiobiose、44%の他のoligo糖を含んでおり、この酵素はエンド型のβ-1,6-glucanaseであることが示された。精製酵素を用いてSaccharomyces cerevisiaeの細胞壁を処理すると、細胞壁glucanに共有結合しているタンパク質が遊離してくることから、この酵素は酵母の細胞壁タンパク質の解析に有用であることが示唆された。

掲載雑誌
Biosci Biotechnol Biochem 66(11), 2515-2519, 2002

5 Two homologous genes, DCW1 (YKL046c) and DFG5, are essential for cell growth and encode glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored membrane proteins required for cell wall biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Sacharomyces cerevisiaeの細胞成長に必須かつ細胞壁生合成に必要なグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)・アンカー膜タンパク質をコードする2つのホモローガスな遺伝子DCW1 (YKL046c) 及びDFG5

著者
Kitagaki H, Wu H, Shimoi H, Ito K.
北垣浩志、呉洪、下飯仁、伊藤清
要約

The cell wall of Saccharomyces cerevisiae consists of glucan, chitin and various kinds of mannoproteins. Major parts of mannoproteins are synthesized as glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins and are then transferred to cell wall beta-1,6-glucan. A glycosyltransferase has been hypothesized to catalyse this transfer reaction. A database search revealed that the products of YKL046c and DFG5 are homologous to bacterial mannosidase. These genes are homologous to each other and have primary structures characteristic of GPI-anchored proteins. Although single disruptants of ykl046c and dfg5 were viable, ykl046cDelta was hypersensitive to a cell wall-digesting enzyme (zymolyase), suggesting that this gene is involved in cell wall biosynthesis. We therefore designated this gene as DCW1 (defective cell wall). A double disruptant of dcw1 and dfg5 was synthetically lethal, indicating that the functions of these gene products are redundant, and at least one of them is required for cell growth. Cells deficient in both Dcw1p and Dfg5p were round and large, had cell walls that contained an increased amount of chitin and secreted a major cell wall protein, Cwp1p, into the medium. Biochemical analyses showed that epitope-tagged Dcw1p is an N-glycosylated, GPI-anchored membrane protein and is localized in the membrane fraction including the cell surface. These results suggest that both Dcw1p and Dfg5p are GPI-anchored membrane proteins and are required for normal biosynthesis of the cell wall.

Sacharomyces cerevisiaeの細胞壁はグルカンとキチン、多様なマンナンタンパク質で構成されている。主要なマンナンタンパク質はグリコシルフォスファチジルイノシトール(GPI)アンカータンパク質として合成され、細胞壁のβ-1,6-グルカンに転移される。我々はこの転移反応を触媒するものとして糖転移酵素を想定した。データベースを検索した結果、YKL046cDFG5がバクテリアのマンノシダーゼとホモロジーを持つことがわかった。これらの遺伝子は相互にホモロジーがあり、GPIアンカータンパク質に特徴的な構造を持つ。ykl046cdfg5の単独破壊株は生育可能であったが、ykl046c破壊株は細胞壁溶解酵素(ザイモリエース)に高感受性であり、YKL046cは細胞壁の生合成に関与していることが示唆された。このことから、我々はこの遺伝子をDCW1 (defective cell wall)と命名した。dcw1dfg5二重破壊株は合成致死であったことから、これらの遺伝子産物の機能は重複しており、少なくともこれらの一つが細胞の成長には必要であることを示された。Dcw1pとDfg5pの両方が欠損した細胞では細胞が大きく丸くなり、細胞壁のキチン含量が多くなり、主要な細胞壁タンパク質であるCwp1pが培地に分泌された。生化学的な解析を行った結果、エピトープを付加したDcw1pはN糖鎖の付加したGPIアンカータンパク質であり、細胞表層を含んだ膜画分に局在していることが明らかとなった。これらの結果は、Dcw1pとDfg5pは共にGPIアンカー型膜タンパク質であり、細胞壁の通常の生合成に必要であることを示唆している。

掲載雑誌
Mol. Microbiol. 46(4), 1011-1022, 2002

(2) 公開特許

1 チトクロームP450nor遺伝子

出願番号
特許出願2001-386472
出願日
2000年12月19日
公開番号
特許公開2002-306187
公開日
2002年10月22日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、月桂冠株式会社
発明者
嘉屋正彦、秦洋二、川戸章嗣、安部康久、秋田修
解決手段

チトクロームP450norタンパク質をコードする2種類の遺伝子のクローニングが行われ、それらのプロモーター部分、コーディング領域、ターミネーター部分を含む全塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入し、得られた発現プラスミッドベクターを宿主菌に導入して形質転換体も得た。

効果

得られた形質転換体を培養することにより、プロモーターが長いタイプ及びそれを短縮したタイプのいずれの遺伝子を用いた場合においても、チトクロームP450norタンパク質を大量生産することが可能となり、また、このようにして大量生産した同酵素は、NOアッセイ、生体内でのNOスカベンジャー等様々な産業分野での利用が可能である。

2003/1/10 掲載

2. 第2四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 Structure and transcription of three chalcone synthase genes of grapevine (Vitis vinifera) ブドウ(Vitis vinifera)の3つのチャルコンシンターゼ遺伝子の構造と転写

著者
N. Goto-Yamamoto, G. H. Wan, K. Masaki, S. Kobayashi
後藤(山本)奈美、万 光華、正木一成、小林省藏
要約

Chalcone synthase catalyzes the first step for the biosynthesis of anthocyanin, which is an important component of grapevine for red wine making. To reveal the details of the gene family of the chalcone synthase of grapevine, three genomic clones of the chalcone synthase gene, Chs1 (AB015872), Chs2 (AB066275), and Chs3 (AB066274), were obtained from Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon, and their structure and mRNA accumulation in grape berry skin and other tissues were compared. The homology between Chs1 and Chs2 (96% on the amino acid level) was higher than the homologies between Chs3 and Chs1 and Chs3 and Chs2 (89% each). Phylogenetic analysis showed that Chs3 was more closely related to morning glory Chs-E and petunia Chs-A than to Chs1 and Chs2. RT-PCR analysis showed that the mRNA of Chs3 accumulated mainly in the berry skin of red cultivars during coloration, while the mRNA of Chs1 and Chs2 accumulated in the leaves and berry skin of a white cultivar as well as red cultivars. Thus, the three Chss of grapevine seemed to be under a different transcription control.

チャルコンシンターゼ(CHS)は、赤ワイン用ブドウの重要な成分であるアントシアニンの生合成系の最初のステップを触媒する酵素である。ブドウのチャルコンシンターゼのgene familyの詳細を明らかにするため、ブドウ、カベルネ・ソービニヨンからの3つのCHS遺伝子、Chs1 (AB015872)、Chs2(AB066275)及びChs3(AB066274)を得て、その構造と果皮やその他の組織におけるmRNAの蓄積を比較した。Chs1Chs2のホモロジー(アミノ酸レベルで96%)は、、Chs3Chs1またはChs2のホモロジー(各89%)よりも高い値であった。系統解析の結果、Chs3Chs1Chs2よりもアサガオのChs-EやペチュニアのChs-Aに近いことが明らかになった。RT-PCRによって、Chs3のmRNAは主に赤品種の果皮で蓄積したが、Chs1Chs2のmRNAは、赤品種だけでなく白品種の果皮や、若い葉でも蓄積した。従ってこれら3つのCHS遺伝子は異なる転写制御を受けていると考えられた。

掲載雑誌
Plant Science, 162, 867-872, 2002

2 Subtractive cloning of cDNA from Aspergillus oryzae differentially regulated between solid-sate culture and liquid (submerged) culture 麹菌で固体培養と液体培養で異なる発現をしている遺伝子のcDNAのクローニング

著者
T. Akao, K. Gomi, K. Goto, O. Okazaki, and O. Akita
赤尾健、五味勝也、後藤邦康、岡崎直人、秋田修
要約

In solid-state cultures (SC), Aspergillus oryzae shows characteristics such as high-level production and secretion of enzymes and hyphal differentiation with asexual development which are absent in liquid (submerged) culture (LC). It was predicted that many of the genes involved in the characteristics of A. oryzae in SC are differentially expressed between SC and LC. We generated two subtracted cDNA libraries with bi-directional cDNA subtractive hybridizations to isolate and identify such genes. Among them, we identified genes upregulated in or specific to SC, such as the AOS (A. oryzae SC-specific gene) series, and those downregulated or not expressed in SC, such as the AOL (A. oryzae LC-specific) series. Sequencing analyses revealed that the AOS series and the AOL series contain genes encoding extra- and intracellular enzymes and transport proteins. However, half were functionally unclassified by nucleotide sequences. Also, by expression profile, the AOS series comprised two groups. These gene products' molecular functions and physiological roles in SC await further investigation.

麹菌は固体培養において、液体培養では見られない酵素の高生産・高分泌、胞子形成などの諸形質を示す。このような固体培養における諸形質の発現は、固体培養において多くの遺伝子が液体培養時とは異なる発現をしているためと推定される。このような遺伝子を取得するため、固体培養と液体培養から得たcDNAを用いて、双方向で差分を行い、2種類の差分化cDNAライブラリーを構築した。このライブラリーから、固体培養で特異的に発現している遺伝子群(AOS)及び固体培養では発現が抑制されている遺伝子群(AOL)を得た。これらの遺伝子群には、菌体内及び菌体外の酵素や透過輸送系に関わるものと推定されるものが含まれていたが、その半数以上は機能未知のものであった。ノザン解析によりAOSの発現様式は2つのに分類できた。これら遺伝子産物の機能解析や固体培養における役割については、現在、研究を進めている。

掲載雑誌
Current Genetics, 41, 275-281, 2002

(2) 取得特許

1 多酸・低アミノ酸酒類製造用酵母の育種

特許番号
特許第3321597号
取得年月日
平成14年6月28日
特許権者
独立行政法人酒類総合研究所
発明者
福田央、家藤治幸、木崎康造、高橋康次郎
課題

ブラスチシジンSに耐性を示す酵母を分離し、その酵母を用いることにより、酸が多く、アミノ酸が少ない酒類を製造する。

解決手段

ブラスチシジンS含有選択培地を用い、ブラスチシジンSに対して耐性を示す酵母を分離し、その酵母を用いて、酸が多く、アミノ酸が少ない酒類を製造する。

効果

酸が多く、アミノ酸が少ない酒類を製造することができる。

2 糸状菌のエンハンサーDNA塩基配列およびその用途

特許番号
特許第3343567号
取得年月日
平成14年8月30日
特許権者
大関株式会社、独立行政法人酒類総合研究所
発明者
峰時俊貴、尾関健二、神田晃敬、布川彌太郎、五味勝也、北本勝ひこ、高橋康次郎、田村學造
目的

糸状菌宿主において使用される有効かつ新規なエンハンサーDNA塩基配列を得る。

構成

DNA塩基配列単位(-CGGNNATTTA-)を含有するDNA塩基配列、該配列を導入した改良プロモーター、プラスミッド、および該プラスミドを用いるポリペプチド製造法。

効果

糸状菌宿主において使用される有効かつ新規なエンハンサーDNA塩基配列、これを導入したプロモーター、そのプロモーターを含む発現用プラスミッド、およびそれを用いた有用タンパク質ならびにペプチドの製造法が提供される。

(3) 公開特許

1 リパーゼ遺伝子

出願番号
特許出願2000-387863
出願日
2000年12月20日
公開番号
特許公開2002-186483
公開日
2002年7月2日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、月桂冠株式会社
発明者
石田博樹、秦洋二、川戸章嗣、秋田修
解決手段

リパーゼ遺伝子のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入することにより宿主(麹菌)を形質転換した。

効果

形質転換体を培養することにより上記酵素を大量に生産することが可能となった。

2 新規チロシナーゼ遺伝子melB

出願番号
特許出願2000-398616
出願日
2000年12月27日
公開番号
特許公開2002-191366
公開日
2002年7月9日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、月桂冠株式会社
発明者
小畑浩、石田博樹、秦洋二、川戸章嗣、安部康久、赤尾健、秋田修、一島英治
解決手段

新規チロシナーゼ遺伝子(melB)のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入することにより宿主(麹菌)を形質転換した。

効果

本遺伝子は固体培養で発現するという特徴を有するものであり、清酒麹の褐変防止、醸造食品の着色防止に利用することができる。また、この形質転換体を培養して本チロシナーゼを生産し、これを試薬として利用できるだけでなく、そのインヒビターにも利用することができ、着色防止物質の開発も期待することができる。

3 発酵麦芽飲料の製造方法

出願番号
特許出願2001-000291
出願日
2001年1月5日
公開番号
特許公開2002-199873
公開日
2002年7月16日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、天野エンザイム株式会社
発明者
佐藤和夫、水野昭博、向井伸彦、天野仁
課題

コク味やボディー感を増強した発酵麦芽飲料を製造する方法を提供する。

解決手段

発酵麦芽飲料の製造過程において、仕込工程における熱処理前にトランスグルコシダーゼを添加し、イソマルトオリゴ糖を生成させる。

4 フラクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子

出願番号
特許出願2001-017640
出願日
2001年1月25日
公開番号
特許公開2002-218982
公開日
2002年8月6日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、月桂冠株式会社
発明者
石田博樹、秦洋二、川戸章嗣、秋田修
解決手段

フラクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入することにより宿主(麹菌)を形質転換した。

効果

形質転換体を培養することにより上記酵素を大量に生産することが可能となった。

5 ラッカーゼ遺伝子

出願番号
特許出願2001-017641
出願日
2001年1月25日
公開番号
特許公開2002-218983
公開日
2002年8月6日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、月桂冠株式会社
発明者
石田博樹、秦洋二、安部康久、赤尾健
解決手段

ラッカーゼ遺伝子のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入することにより宿主(麹菌)を形質転換した。

効果

形質転換体を培養することにより上記酵素を大量に生産することが可能となった。

6 カタラーゼA遺伝子

出願番号
特許出願2001-026150
出願日
2001年2月1日
公開番号
特許公開2002-223772
公開日
2002年8月13日
出願人
月桂冠株式会社、独立行政法人酒類総合研究所
発明者
久田博元、川戸章嗣、安部康久、後藤邦康
解決手段

麹菌由来のカタラーゼA遺伝子のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入することにより宿主(麹菌)を形質転換した。

効果

形質転換体を培養することにより上記酵素を大量に生産することが可能となった。

7 バイディーゼル(モノアルキルエステル)の製造方法

出願番号
特許出願2001-030066
出願日
2001年2月6日
公開番号
特許公開2002-233393
公開日
2002年8月20日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所
発明者
家藤治幸、カミニ・エヌ・アール、藤井力、黒須猛行、岡崎直人
解決手段

油脂とアルコールの存在下、Cryptococcus属酵母(FERMP-15155)由来のリパーゼを用いて油脂のエステル化反応を行うこと、を特徴とするバイオディーゼルの製造方法。

効果

アルコールを逐次添加することなくワンステップで効率的に反応が行われるだけでなく、有機溶媒や水分の混在下でも効率的にバイオディーゼルを製造することができる。

8 変異PDR3遺伝子による高アルコール生産酵母の育種法

出願番号
特許出願2001-045406
出願日
2001年2月21日
公開番号
特許公開2002-238582
公開日
2002年8月27日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所
発明者
福田央、若林三郎
解決手段

変異PDR3遺伝子を導入し、これを発現せしめることによる高アルコール生産酵母の育種法。

効果

効率よく高アルコール生産酵母を分離、採取することができ、得られた新規高アルコール生産酵母を使用することによって、アルコール含有量の高い清酒その他の酒類を製造することができる。

9 ビールの製造方法

出願番号
特許出願2001-059573
出願日
2001年3月5日
公開番号
特許公開2002-253197
公開日
2002年9月10日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、天野エンザイム株式会社
発明者
水野昭博、向井伸彦、佐藤和夫、天野仁
課題

高濃度醸造でありながら発酵を促進させ酢酸生成量を低下させるビールの製造方法及び麦汁エキス濃度に左右されず真性発酵度を高めることにより簡単な製造工程で高品質の低カロリービールを製造できるビールの製造方法並びにビール酵母では得られない新規な品質を有するビール又は低カロリービールの製造方法を提供すること。

解決手段

ビールの高濃度醸造において、発酵工程でα-グルコシダーゼを作用させるビールの製造方法又は発酵工程でα-グルコシダーゼを作用させて酢酸生成量を低減させるビールの製造法に関する。更に、ビールの醸造において、発酵工程でα-グルコシダーゼを作用させて真性発酵度を高める低カロリービールの製造方法に関する。上記いずれの発明においても、ビール酵母以外の醸造用酵母を用いてもよい。

10 D-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子

出願番号
特許出願2001-055241
出願日
2001年2月28日
公開番号
特許公開2002-253246
公開日
2002年9月10日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、月桂冠株式会社
発明者
小畑浩、秦洋二、安部康久、秋田修
解決手段

D-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入することにより宿主(麹菌)を形質転換した。

効果

形質転換体を培養することにより上記酵素を大量に生産することが可能となった。

11 メタロチオネイン遺伝子

出願番号
特許出願2001-055664
出願日
2001年2月28日
公開番号
特許公開2002-253250
公開日
2002年9月10日
出願人
月桂冠株式会社、独立行政法人酒類総合研究所
発明者
石田博樹、秦洋二、川戸章嗣、後藤邦康
解決手段

メタロチオネイン遺伝子のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をグルコアミラーゼ遺伝子断片とともにベクターに挿入することにより宿主(麹菌)を形質転換した。

効果

形質転換体を培養することにより上記タンパク質を融合タンパク質として大量に生産することが可能となった。

2002/10/10 掲載

1. 第1四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 The AWA1 Gene Is Required for the Foam-Forming Phenotype and Cell Surface Hydrophobicity of Sake Yeast AWA1 遺伝子は清酒酵母の高泡形成と細胞表層の疎水性に必要である

著者
H. Shimoi, K. Sakamoto, M. Okuda, R. Atthi, K. Iwashita, and K. Ito
下飯仁、坂本和俊、奥田将生、Ratchanee Atthi、岩下和裕、伊藤清
要約

Sake, a traditional alcoholic beverage in Japan, is brewed with sake yeasts, which are classified as Saccharomyces cerevisiae. Almost all sake yeasts form a thick foam layer on sake mash during the fermentation process because of their cell surface hydrophobicity, which increases the cells' affinity for bubbles. To reduce the amount of foam, nonfoaming mutants were bred from foaming sake yeasts. Nonfoaming mutants have hydrophilic cell surfaces and no affinity for bubbles. We have cloned a gene from a foam-forming sake yeast that confers foaming ability to a nonfoaming mutant. This gene was named AWA1 and structures of the gene and its product were analyzed. The N- and C-terminal regions of Awa1p have the characteristic sequences of a glycosylphosphatidylinositol anchor protein. The entire protein is rich in serine and threonine residues and has a lot of repetitive sequences. These results suggest that Awa1p is localized in the cell wall. This was confirmed by immunofluorescence microscopy and Western blotting analysis using hemagglutinin-tagged Awa1p. Moreover, an awa1 disruptant of sake yeast was hydrophilic and showed a nonfoaming phenotype in sake mash. We conclude that Awa1p is a cell wall protein and is required for the foam-forming phenotype and the cell surface hydrophobicity of sake yeast.

清酒は、Saccharomyces cerevisiaeに分類される清酒酵母によって醸造される日本の伝統的なアルコール飲料である。ほとんどの清酒酵母は、発酵時に厚い泡の層を形成する。これは、清酒酵母の細胞表層が疎水性であるため、細胞が気泡に吸着するためである。泡の量を少なくするために、泡あり酵母から泡なし酵母が育種されている。泡なし酵母の細胞表層は親水性であり、気泡に吸着しない。我々は、泡あり酵母から泡なし酵母に高泡形成能を付与する遺伝子をクローニングし、AWA1と名づけた。AWA1タンパク質のN末端とC末端には、GPIアンカータンパク質に特徴的な疎水生のアミノ酸配列が存在した。AWA1タンパク質は全体にセリン・スレオニンリッチであり、多くの繰返し配列を含んでいた。これらの結果は、AWA1タンパク質が細胞壁に局在していることを示唆している。このことは、HAタグを付与したAWA1タンパク質の局在性を解析することで、確認された。AWA1遺伝子の破壊株は親水性であり、泡なしであった。

掲載雑誌
Applied and Environmental Microbiology, 68, 2018-2025, 2002

2 Properties of Cellulose-Degrading Enzymes from Aspergillus oryzae and Their Contribution for Material Utilization and Alcohol Yield in Sake Mash Fermentation 麹菌Aspergillus oryzaeが生産するセルロース分解酵素の性質とその清酒もろみ発酵での原料利用とアルコール収得に対する効果

著者
Y. Yamane, J. Fujita, S. Izuwa, K. Fukuchi, R. Shimizu, A. Hiyoshi, H. Fukuda, S. Mikami, Y. Kizaki and S. Wakabayashi
山根雄一、藤田仁、出羽信也、福地香、清水隆一、日吉智、福田央、三上重明、木崎康造、若林三郎
要約

Four cellulose-degrading enzymes were recognized in the solid-state culture of Aspergillus oryzae. Three major enzymes were purified and named Cel-1, Cel-2, and Cel-3, respectively. The molecular weights were determined to be 62, 120, and 34 kDa, respectively. The optimum temperature of Cel-3 was higher than the others. An acidic pH was found to be better for Cel-1 than the others, and Cel-3 was more stable under the acidic condition than the other two. These obtained properties and the protein homology search for N-terminal amino acid sequences suggest that Cel-1 and Cel-3 correspond to the previously isolated endo-1,4-β-glucanase CelB and CelA, respectively. The analysis for substrate specificity suggested that Cel-2 is likely β-glucosidase. The effect of Cel-1, Cel-2, and Cel-3 on the sake mash fermentation was examined and found that Cel-2 could give an extreme improvement on the material utilization and alcohol yield in sake mash fermentation.

固体培養条件において、麹菌Aspergillus oryzaeが4種のセルラーゼを生産することを確認した。このうち生産量が多い3種のセルラーゼを分離精製し、それぞれCel-1、Cel-2、及びCel-3と名付けた。分子量はそれぞれ62、120、及び34kDaであった。至適反応温度はCel-3が最も高かった。至適pHはCel-1が最も酸性側であった反面、Cel-3が酸性条件で最もの安定であった。これらの諸性質とN-末端アミノ酸配列の分析結果から、Cel-1及びCel-3は、先にA.oryzaeから同定されているエンド-1,4-β-グルカナーゼCelB及びCelAにあたると推定された。また基質特異性の解析結果から、Cel-2はβ-グルコシダーゼであると推定された。清酒もろみの発酵経過に対するCel-1、Cel-2、及びCel-3の添加効果を検討したところ、その原料利用率とアルコール収得に対しCel-2が最も顕著な促進効果を示した。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering, 93, 479-484, 2002

3 破精の形成要因

著者
須藤茂俊、小関卓也、木崎康造
要約

黄麹菌と蒸米を用いて、麹の破精の形成要因と製麹管理指標としての破精の妥当性について検討した。破精の形成は麹米の蒸米吸水率に強く依存した。破精の形成と麹菌の増殖との関係は、蒸米吸水率40%では両者は概ね相関し、破精は増殖の代替指標として適当と考えられた。一方、蒸米吸水率70%では菌糸が増殖しても破精はほとんど形成されず、代替指標として適当ではなかった。顕微鏡観察によれば、菌糸の伸長とともに麹表面には帯状またはトンネル状の浸食痕が形成され、また、麹内部には蒸米組織の粒状化崩壊が認められた。これらはいずれも光を乱反射する性質が認められたことから、菌糸とともに破精の形成要因であると考えられた。破精の形成と酵素生産との関係を調べたところ、醪の順調な発酵に必要な酵素生産との観点では、蒸米吸水率にかかわらず破精は酵素生産の代替指標として適当であると考えられた。

掲載雑誌
日本醸造協会誌 97, 369-376, 2002

(2) 公開特許

1 α-L-アラビノフラノシダーゼ遺伝子

出願番号
特許出願2000-316570
出願日
2000年10月17日
公開番号
特許公開2002-119289
公開日
2002年4月23日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、月桂冠株式会社
発明者
小畑浩、秦洋二、川戸章嗣、赤尾健
解決手段

α-L-アラビノフラノシダーゼ遺伝子のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入することにより宿主(麹菌)を形質転換した。

効果

形質転換体を培養することにより上記酵素を大量に生産することが可能となった。

2 古酒風味酒類の製造法

出願番号
特許出願2000-336619
出願日
2000年11月2日
公開番号
特許公開2002-136282
公開日
2002年5月14日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所
発明者
藤田仁、木崎康造、福田央、若林三郎
解決手段

清酒粕を60℃以上80℃以下で加熱したのち、この加熱済み清酒粕に清酒を添加して、その風味を移行させた後に、固形物を除去することにより古酒風味酒類を製造する。

効果

容易に古酒風味酒類が製造できる。

3 アミンオキシダーゼ遺伝子

出願番号
特許出願2000-336664
出願日
2000年11月2日
公開番号
特許公開2002-136290
公開日
2002年5月14日
出願人
国税庁長官、月桂冠株式会社
発明者
久田博元、秦洋二、安部康久、後藤邦康
解決手段

アミンオキシダーゼ遺伝子のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入することにより宿主(麹菌)を形質転換した。

効果

形質転換体を培養することにより上記酵素を大量に生産することが可能となった。

4 ガラクトースオキシダーゼ遺伝子

出願番号
特許出願2000-366023
出願日
2000年11月30日
公開番号
特許公開2002-165596
公開日
2002年6月11日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、月桂冠株式会社
発明者
小畑浩、秦洋二、川戸章嗣、秋田修
解決手段

ガラクトースオキシダーゼ遺伝子のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入することにより宿主(麹菌)を形質転換した。

効果

形質転換体を培養することにより上記酵素を大量に生産することが可能となった。

2002/7/10 掲載