平成19年度 研究成果

4. 第4四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 Biochemical characterization of a glycoside hydrolase family 61 endoglucanase from Aspergillus kawachii Aspergillus kawachii の糖質加水分解酵素ファミリー61に属するエンドグルカナーゼの生化学的特徴

著者
T. Koseki, Y. Mese, S. Fushinobu, K. Masaki, T. Fujii, K. Ito, Y. Shiono, T. Murayama, H. Iefuji
小関卓也、目瀬友一朗、伏信進矢、正木和夫、藤井力、伊藤清、塩野義人、村山哲也、家藤治幸
要約

The glycoside hydrolase family 61 endoglucanase from Aspergillus kawachii (AkCel61) is a modular enzyme that consists of a catalytic domain and a carbohydrate-binding module belonging to family 1 (CBM1) that are connected by a Ser-Thr linker region longer than 100 amino acids. We expressed the recombinant AkCel61, wild-type enzyme (rAkCel61), and a truncated enzyme consisting of the catalytic domain (rAkCel61ΔCBM) in Pichia pastoris and analyzed their biochemical properties. Purified rAkCel61 and rAkCel61ΔCBM migrated on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and were demonstrated to have apparent molecular masses of 81,000 and 34,000 Da, respectively. After treatment with endoglycosidase H, both proteins showed an increase in mobility, thus, demonstrating estimated molecular masses of 78,000 and 28,000 Da, respectively. Mass spectrometry analysis revealed that rAkCel61 and rAkCel61ΔCBM expressed in P. pastoris are heterogeneous due to protein glycosylation. The rAkCel61 protein bound to crystalline cellulose but not to arabinoxylan. The rAkCel61 and rAkCel61ΔCBM proteins produced small amounts of oligosaccharides from soluble carboxymethylcellulose. They also exhibited a slight hydrolytic activity toward laminarin. However, they showed no detectable activity toward microcrystalline cellulose, arabinoxylan, and pectin. Both recombinant enzymes also showed no detectable activity toward p-nitrophenyl -D-glucoside, p-nitrophenyl -D-cellobioside, and p-nitrophenyl -D-cellotrioside.

A. kawachii由来の糖質加水分解酵素ファミリー61のエンドグルカナーゼ(AkCe161)は、触媒部位と、100アミノ酸を超えるセリン-スレオニンリンカーで結合したファミリー1の炭化水素結合部位(CBM1)からなるモジュラー酵素である。我々はAkCe161の組換え酵素として、野生型の酵素rAkcel61と、触媒部位からなる短い酵素rAkcecl61ΔCBMをPichia pastorisで発現させ、生化学的特性を調べた。精製したrAkcel61とrAkcecl61ΔCBMの分子量はSDS‐PAGEでそれぞれ、81,000Da、34,000Daと推定され、EndoHによる脱糖鎖後は78,000Da、 28,000Daと推測された。質量分析の結果、P. pastorisで発現させたrAkcel61とrAkcecl61ΔCBMは、糖鎖修飾のため、ヘテロであることが分かった。rAkCe161は結晶セルロースに結合したが、アラビノキシランには結合しなかった。rAkCe161及びrAkCe161ΔCBMは、少量のオリゴ糖を、可溶性のカルボキシメチルセルロースから産生した。また、ラミナリンに対しても僅かな加水分解活性を示したが、微結晶セルロース、アラビノキシラン、及びペクチンには検出可能な活性を示さなかった。また、両組換え酵素は、 p-ニトロフェニルβ-D-グルコシドや、p-ニトロフェニルβ-D-セロビサイド、p-ニトロフェニルβ-D-セロトリサイドに対しても検出可能な活性を示さなかった。

掲載雑誌
Appl Microbiol Biotechnol. 77(6), 1279-1285 (2008)

(2) 公開特許

1 特定の麹菌の同定方法

出願番号
特許出願2006-185129 (P2006-185129)
出願日
2006年7月5日
公開番号
特許公開2008-11751(P2007-11751A)
公開日
2008年1月24日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所
発明者
山田修、坂本和俊、リー・ユン・ハエ、秋田修
課題

麹菌のうち、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している菌株を簡便に識別する方法及びそのためのプライマーセットを提供すること。

解決手段

アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している麹菌の菌株のゲノムDNA中には、この欠損に起因して生じる特異的な分断部位が存在する。この特異的分断部位を、核酸増幅法等を駆使して検出することにより、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損し、このためアフラトキシンを産生する可能性が全くない麹菌を同定することができる。

2 生存性の低い胞子を作る糸状菌の作成方法

出願番号
特許出願2006-233065 (P2006-233065)
出願日
2006年8月30日
公開番号
特許公開2008-54542(P2007-54542A)
公開日
2008年3月13日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所
発明者
坂本和俊、山田修、岩下和裕、秋田修
課題

形質転換の宿主となる糸状菌の胞子のストレス抵抗性を低減させることで、管理区域外に飛散した糸状菌胞子を死滅しやすくさせる、生存性の低い胞子を作る糸状菌の作成方法及び生存性の低い胞子を作る糸状菌を提供すること。

解決手段

糸状菌の胞子の生存性を低減させる方法は、糸状菌の転写制御因子タンパク質をコードするatfA遺伝子のコード領域の全部若しくは一部を欠失させ又は変異させて前記糸状菌の胞子の生存性を低減させることを含む。

2008/4/4 掲載

3. 第3四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 清酒経験、清酒摂取時の摂食状況、咽下の有無が清酒の嗜好に及ぼす影響 Effects of experience, eating habits, and way of drinking on sake preference

著者
眞鍋康子、宇都宮仁、伊豆英恵、木曽邦明、伏木亨
Yasuko Manabe, Hitoshi Utsunomiya, Hanae Izu, Kuniaki Kiso, and Tohru Fushiki
要約

清酒の嗜好を検討するため、清酒の飲酒及び評価経験に応じて被験者を分け、咽下を伴わない口腔内刺激による嗜好評価試験、1時間の飲酒試験の二つの方法により検討した。さらに、生理的嗜好を反映していると考えられるラットの清酒の嗜好とヒトの清酒の嗜好との関連性についての検討を行った。その結果、

  1. 清酒製造業に携わり、官能評価の経験を有する被験者群においては、口腔内刺激による清酒の嗜好と飲酒試験による摂取量比に基づく清酒の嗜好がほぼ同じであり、これらの嗜好はラットで観察される嗜好とは異なっていた。
  2. 清酒経験が浅い被験者群においては、空腹状況下では口腔内刺激による嗜好と飲酒試験の嗜好が異なっていた。一方、飲酒開始30分以降の清酒の嗜好はラットの清酒の嗜好と相関しており、飲酒により嗜好が変化することが示された。
  3. 摂食後の飲酒試験においては、清酒経験が浅い被験者群でもラットの清酒の嗜好との相関は観察されず、嗜好変化は空腹状況下に特異的に観察される現象であることが明らかになった。

Palatability of food is affected by not only taste, but also physiological alteration after ingestion. To understand whether the palatability of sake in the oral sensation is also affected by its ingestion, we examined the relation between the preference order based on the preference test without swallowing sake and that based on the intake volume for 1hr in experienced sake tasters and sake beginners. We also investigated whether the palatability of sake in humans is similar to that in rats, whose preference is mostly attributed to the instinctive and physiological appetite. In the experienced sake tasters under fasting condition, the preference rank based on the intake volume was not affected by the ingestion of sake, which did not correspond to the rat preferences. The preference rank of the sake beginners under fasting differed between the experiments with or without swallowing sake, while their preference rank after eating was independent of the way of drinking. The preference rank of the sake beginners under fasting is affected by the way of drinking, but that of the experienced sake tasters remained unchanged.

掲載雑誌
日本醸造学会誌、第102巻、第12号、897-906、(2007)

2 Elevated expression of genes under the control of stress response element (STRE) and Msn2p in an ethanol tolerance sake yeast Kyokai no.11 エタノール耐性清酒酵母きょうかい11号におけるストレスレスポンスエレメント(STRE)及びMsn2pの制御を受ける遺伝子の高発現

著者
Mamoru Watanabe, Kenichi Tamura, Jose Paolo Magbanua, Kaname Takano, Katsuhiko Kitamoto, Hiroshi Kitagaki, Takeshi Akao and Hitoshi Shimoi,
渡辺守、田村健一、ホセ・パオロ・マグバヌア、高野要、北本勝ひこ、北垣浩志、赤尾健、下飯仁
要約

The sake yeast strain Kyokai no. 11 (K11) is an ethanol tolerant mutant of strain Kyokai no. 7 (K7), which shows higher viability in an ethanol solution than strain K7. To clarify the mechanism underlying the ethanol tolerance of this strain, the gene expression profiles of K7 and K11 were analyzed using DNA microarrays. The results indicate that many genes induced by stresses were highly expressed in strain K11 not expected to stresses. Analysis of HSP12, one of the most highly expressed genes in strain K11 compared with strain K7, revealed that a trans-acting factor of strain K11 was involved in the elevated expression of HSP12. Many of the highly expressed genes in strain K11 including HSP12 were under the control of a cis-acting factor called the stress response element (STRE). The addition of STRE sequences to a promoter region of a reporter gene resulted in constitutive high-level expression in strain K11. It was reported that transcription factors Msn2p and Msn4p bind to STRE sequences. DNA sequence analyses of MSN2 and MSN4 of strains K7 and K11 revealed that only Msn2p was functional in these strains. When two copies of MSN2 in strain K11 were disrupted, the expression level of the reporter gene under the control of STRE decreased to the level of strain K7, indicating that Msn2p is required for the elevated expression of the STRE-controlled genes in K11.

清酒酵母きょうかい11号((K11)はきょうかい7号((K7)のエタノール耐性株であり、K11はエタノール水溶液中でK7より高い生存率を示す。この株のエタノール耐性のメカニズムを理解するために、K7とK11の遺伝子発現プロファイルをDNAマイクロアレイを用いて解析した結果、K11ではストレスによって誘導される多くの遺伝子がストレスのない状態でも高発現していることがわかった。K7と比べてK11でもっとも高発現していた遺伝子であるHSP12の解析によって、K11のトランス因子がHSP12の発現上昇に関与することがわかった。HSP12を含むK11で高発現した遺伝子の多くはstress response element (STRE) と呼ばれるシス因子の制御化にあった。STRE配列を付加したプロモーター領域を持つレポーター遺伝子は、K11で構成的に高いレベルで発現した。STRE配列には転写因子Msn2pとMsn4pが結合することが知られている。K7とK11のMSN2MSN4のDNAシークエンス解析の結果、これらの株ではMsn2pのみが機能的であることがわかった。K11の2コピーのMSN2を破壊すると、STREの制御下にあるレポーター遺伝子の発現はK7と同等のレベルにまで低下した。以上の結果から、Msn2がK11でのSTREの制御下にある遺伝子の高発現に必要であることがわかった。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering、104、163-170、(2007)

3 ブドウ栽培における殺菌剤キャプタンの施用とその発酵阻害作用について Application of Pesticide Captan in Viticulture and Its Inhibitory Effect on Fermentation

著者
後藤(山本)奈美、山下裕之、橋口知一、沼田美子代
Nami GOTO-YAMAMOTO, Hiroyuki YAMASHITA, Tomokazu HASHIGUCHI, Mineyo NUMATA
要約

殺菌剤のキャプタン(N-トリクロロメチルチオ-4-シクロヘキセン-1,2-ジカルボキシイミド)はワイン醸造のアルコール発酵を阻害すると報告されている。しかし、わが国では詳しい情報が得られないことから、キャプタンの発酵阻害作用を、キャプタンを添加した小仕込み試験で検討した。赤ワイン醸造では、5 mg/Lのキャプタンは発酵開始を1-2日遅延させた。白ワインやブラッシュワイン醸造では、1 mg/Lのキャプタンは発酵開始を1日、3 mg/Lでは2日~数日遅延させた。従って、キャプタンの残留値が日本の基準(5 mg/kg 果粒)以下であっても、ワイン醸造ではその濃度に注意が必要であることが示された。しかし、収穫30日前にキャプタンを散布したメルロでは、発酵に影響が認められず、官能評価結果にも影響しなかった。以前に報告されているように、キャプタンは酸性条件で徐々に分解されたものと推定される。

The pesticide Captan (N-trichloromethylthio-4-cyclohexene-1,2-dicarboximide) has been reported to inhibit alcohol fermentation during wine making. However, further information on this effect is not available in Japan. Therefore, we investigated the inhibitory effect of Captan by adding it to a small-scale vinification process. In the making of red wine, Captan at 5 mg/L delayed the onset of fermentation by 1 to 2 days. In white or blush wine making, Captan at 1 mg/L delayed the onset by 1 day, and that at 3 mg/L delayed the onset by 2 to several days. Thus, even if the residual concentration of Captan is lower than that specified by Japanese regulations (5 mg/kg of grape berries, without stem), the concentration must be considered in wine making. Notably, when applied to Merlot grapes at 30 days before harvest, Captan did not influence the fermentation profile or the sensory evaluation of the wine produced. As Captan was not detected in the wine after fermentation, it is surmised that Captan gradually degraded under acidic conditions, as has previously been reported.

掲載雑誌
日本ブドウ・ワイン学会誌、18、79-84、(2007)

4 ブドウ'ミュラー・トゥルガウ'の成熟経過におけるモノテルペン類の変化とワイン中のモノテルペン濃度に及ぼす醸造条件の影響 Change in Monoterpene Concentration of Grapes during Berry Development and Influence of Vinification Conditions on Monoterpene Concentration in Muller-Thurgau Wine

著者
相馬紀子、後藤(山本)奈美、磯谷敦子、古川準三
Noriko SOMA, Nami GOTO-YAMAMOTO , Atsuko ISOGAI, Jyunzo FURUKAWA
要約

モノテルペンアルコールはミュラー・トゥルガウワインの香に寄与していると考えられている。本研究ではミュラー・トゥルガウブドウの成熟中のモノテルペン濃度の変化と、ブドウの熟度や醸造用ペクチナーゼ剤の使用がミュラー・トゥルガウワインのモノテルペン濃度に及ぼす影響を検討した。結合型及び遊離型とも、リナロールがミュラー・トゥルガウブドウの主要なモノテルペンで、モノテルペン総量はブドウの成熟に伴って増加した。開花後14週目(過熟)のブドウから醸造したワインは、10週目のブドウから醸造したワインより高い官能評価を受けた。グリコシダーゼ活性を有する醸造用ペクチナーゼ剤はミュラー・トゥルガウワインのモノテルペンを増加させ、官能評価結果も向上した。しかし、ペクチナーゼ剤で増加したモノテルペン濃度のエタノール溶液では、官能的に香の変化が検知できなかった。従って、ペクチナーゼ剤処理はモノテルペンと同時に未知の香気成分を増加させている可能性が示唆された。

Monoterpene alcohols are known to contribute to the aroma of Muller-Thurgau wine. In this study, we examined the change in monoterpene concentration of Muller-Thurgau grapes during maturation. Also, the effects of grape maturity and enological pectinase preparations on the monoterpene concentration in Muller-Thurgau wine were investigated. Linalool was the major monoterpene in Muller-Thurgau grapes, existing in both free and bound forms, and the total concentration of monoterpenes increased during maturation. Muller-Thurgau wine made from grapes collected 14 weeks after flowering (overripe) contained higher levels of monoterpenes and received higher organoleptic evaluation than wine made from 10-week-old grapes. Treatment with enological pectinase preparations possessing glycosidase activity increased the monoterpene concentration in Muller-Thurgau wine and improved the results of organoleptic evaluation. However, the increased monoterpene concentrations were not organoleptically detectable in ethanol solution. Thus, the enzyme treatment possibly increases the concentrations of unknown aroma compounds as well as monoterpenes.

掲載雑誌
日本ブドウ・ワイン学会誌、18、85-93、(2007)

5 Cloning and expression of GDP-D-mannose pyrophosphorylase gene and ascorbic acid content of acerola (Malpighia glabra L.) fruit at ripening stages GDP-D-マンノースピロフォスフォリラーゼ遺伝子のクローニング及び発現とアセロラ(Malpighia glabra L.)果実成熟中のアスコルビン酸含量

著者
Adebanjo A. Badejo, Seok T. Jeong, Nami Goto-Yamamoto, Muneharu Esaka
Adebanjo A. Badejo、鄭硯泰、後藤(山本)奈美、江坂宗春
要約

Acerola (Malpighia glabra L.) is one of the richest natural sources of L-ascorbic acid (AsA; vitamin C). GDP-D-mannose pyrophosphorylase (GMP; EC 2.7.7.13) was found to play a major role in the proposed AsA biosynthetic pathway in plants, considering that Arabidopsis vtc1-1 mutant with point mutation in this gene has a highly reduced AsA content. GMP cDNA was isolated from acerola fruits, designated MgGMP, using rapid amplification of cDNA ends (RACE), and its expression was monitored during fruit ripening. The full-length cDNA was found to have an ORF of 1083 bp encoding a polypeptide of 361 amino acids. In silico analysis of the predicted amino acid sequence showed a pI of 6.45 and molecular mass of 39.7 kD. MgGMP showed over 80% amino acid sequence identity with other plant GMP homologues. The phylogenetic tree shows the close relation of MgGMP to the GMP of other plants as against those from parasite, yeasts and mammals. Southern analysis indicated that M. glabra contains not less than two copies of GMP genes. Northern blot analysis showed the transcript abundance of MgGMP in all the organs of acerola examined, with the fruit having the highest expression. The relative transcript abundance of MgGMP mRNA levels in the fruits changes as the ripening process progresses, with the unripe green fruits having the highest relative mRNA level, and the lowest was found in the fruits at advanced ripening stage. A strong correlation was also observed between the relative MgGMP mRNA levels and the AsA contents of acerola during fruit ripening.

アセロラは最も高濃度なL-アスコルビン酸(AsA)の自然の供給源の1つである。GPD-D-マンノースピロフォスフォリラーゼ(GMP;EC 2.7.7.13)は植物で提唱されているAsA合成系で重要な働きをしており、この遺伝子に点突然変異を持つアラビドプシスvtc1-1変異体は還元型AsAを高濃度に蓄積する。アセロラの果実からGMPのcDNA(MgGMP)をRACE法でクローニングした。全長のcDNAは、361アミノ酸残基をコードする1083bpのORFを持っており、予想アミノ酸配列からpI 6.45、分子量39.7kdと推定された。MgGMPは他の植物のGMPと80%以上のアミノ酸配列の相同性を示し、系統解析によって、酵母や動物などのGMPより他の植物のGMPに近縁であることが示された。サザン解析の結果、アセロラは少なくとも2コピーのGMP遺伝子を持つことが示された。ノーザン解析の結果、供試したアセロラの器官のなかで果実での転写産物濃度が最も高いことが示された。果実では、未熟な果実でのmRNAレベルが最も高く、成熟果実で最も低かった。果実の成熟中のMgGMPのmRNAレベルとAsA含量には強い相関が認められた。

掲載雑誌
Plant Physiology and Biochemistry 45、665-672 (2007)

6 Protein expression of Saccharomyces cerevisiae in response to uranium exposure ウランに曝された酵母Saccharomyces cerevisiaeのタンパク質の発現

著者
F.Sakamoto, T.Nankawa, N.Kozai, T.Fujii, H.Iefuji, A.J.Francis, T.Ohnuki
坂本文徳、南川卓也、香西直文、藤井力、家藤治幸、A.J.Francis、大貫俊彦
要約

Protein expression of Saccharomyces cerevisiae grown in the medium containing 238U(VI) and 233U(VI) was examined by two-dimensional gel electrophoresis. Saccharomyces cerevisiae of BY4743 was grown in yeast nitrogen base medium containing glucose and glycerol 2-phosphate and 238U of 0, 2.0, and 5.0 × 10-4 M or 233U of 2.5 × 10-6 M (radioactivity was higher by 350 times than 2.0 × 10-4 M 238U) and 5.0 × 10-6 M for 112 h at 30 ℃. The growth of Saccharomyces cerevisiae was monitored by measuring OD600 at 112 h after the inoculation. Uranium concentrations in the media also were measured by radiometry using a liquid scintillation counter. The growths of the yeast grown in the above media were in the following order: control > 2.5 × 10-6 M 233U > 2.0 × 10-4 M 238U > 5.0 × 10-6 M 233U > 5.0 × 10-4 M 238U. This result indicated that not only radiological but also chemical effect of U reduced the growth of the yeast. The concentrations of U in the medium containing 238U or 233U decreased, suggesting U accumulation by the yeast cells. The 2-D gel electrophoresis analysis showed the appearance of several spots after exposure to 238U or to 233U but not in the control containing no uranium. These results show that the yeast cells exposed to U express several specific proteins.

238U(VI)や 233U(VI) を含む培地で培養したSaccharomyces cerevisiaeのタンパク質の発現を2次元電気泳動法で確認した。Saccharomyces cerevisiaeのBY4743株をYeast Nitrogen Base培地にグルコース、グリセロール2リン酸と238Uを0, 2.0, 5. 0 × 10-4 M含む培地、または233Uを2.5× 10-4 M含む培地(238Uを2.0× 10-4 M含む培地と比較すると放射能で350倍高い), 5. 0 × 10-4 M含む培地にて、30℃で112時間培養した。Saccharomyces cerevisiaeの増殖は植菌してから112時間目にOD600を測定することで計測した。培地中のウラン濃度は液体シンチレーションカウンターを用いた放射線測定により測定した。酵母の増殖は次の順番であった:対照> 2.5 × 10-6 M 233U > 2.0 × 10-4 M 238U > 5.0 × 10-6 M 233U > 5.0 × 10-4 M 238U。この結果は、放射線の効果だけでなくウランの化学的効果が酵母の増殖に影響を与えていることを示している。238Uや233Uを含む培地のウラン濃度は減少し、酵母細胞にウランが蓄積されたことが示唆された。2次元電気泳動では、238Uや233Uに曝した後、いくつかのスポットがあらわれたが、ウランを含まない対照ではあらわれなかった。これらの結果は、ウランに曝された酵母細胞はいくつかの特殊なタンパク質を発現していることを示している。

掲載雑誌
Journal of Nuclear and Radiochemical Sciences, 8(2), 99-102 (2007)

7 Bitter-tasting Sake Peptides derived from the N-Terminus of the Rice Glutelin Acidic Subunit イネグルテリン酸性サブユニットに由来する清酒の苦味ペプチド

著者
Katsumi HASHIZUME, Masaki OKUDA, Mineyo NUMATA, Kazuhiro IWASHITA
橋爪克己、奥田将生、沼田美子代、岩下和裕
要約

Five bitter-tasting peptides were isolated from charcoal-untreated sake, following a Sepabeads resin separation, an initial reverse-phase chromatography (RP-HPLC), a gel permeation-chromatography, and a second RP-HPLC. The isolated peptides consisted of six to thirteen amino acid residues. The N-termini were uniformly pyroglutamate residues. Based on the rice protein database, the peptides were derived from two different N-termini of the rice glutelin acidic subunit. One of them was reported as a prolyl endopeptidase inhibitor. The thirteen-amino acid peptides in charcoal-untreated ginjyo-type sakes were lower than that in charcoal-untreated jyunmai-type sakes. The thirteen-amino acid peptides were not detected in the commercial ordinary-type sake analyzed. The concentration of analyzed peptides of nine to thirteen amino acid residues in charcoal-untreated sake exceeded their preliminary estimated sensory threshold values, suggesting that they contribute to the sensory quality of charcoal-untreated sake.

5つの苦味ペプチドを、セパビーズ樹脂分離、逆相HPLC、ゲルろ過、再逆送HPLCによって、活性炭未処理の清酒試料から単離した。単離ペプチドは6から13アミノ酸残基で構成され、そのN末端は全てピログルタミル基であった。イネタンパク質データベース検索から、単離ペプチドは2つの異なる米グルテリン酸性サブユニットに由来した。単離ペプチドの一つはプロリルエンドペプチダーゼインヒビターとして報告されていた。吟醸酒中の13残基アミノ酸ペプチドの濃度は、純米酒中のペプチド濃度よりも有意に低く、分析した市販普通清酒には検出されなかった。予備的に推定した9~13アミノ酸残基の単離ペプチドの活性炭未処理清酒中の濃度は、推定した閾値よりもはるかに高かった。この結果は、単離ペプチドが活性炭素未処理の清酒の官能的な品質に関与し得ることを示唆している。

掲載雑誌
Food Sci. Technol. Res., 13(3),270-274,2007

8 Characterization of Peptides Generated in Proteolytic Digest of Steamed Rice Grains by Sake Koji Enzymes 清酒麹酵素による蒸米のタンパク質消化時に生じるペプチドの解析

著者
Katsumi Hashizume, Masaki Okuda, Mineyo Numata, Yan Zhou, and Takuya Koseki
橋爪克己、奥田将生、沼田美子代、周延、小関卓也
要約

High-molecular-weight peptides (approximately 10-30 kDa) generated in a digest of steamed rice grains by sake koji enzymes were characterized. Among thirteen major spots resolved by 2-D gel electrophoresis, twelve contained peptides having N-termini of rice glutelin as determined by mass fingerprinting analysis and/or MS/MS. The source of these peptides was presumed to be the acidic subunit of rice glutelin. An addition of up to 25% glucose in the digestion of an isolated rice protein body induced the accumulation of these peptides. The level of accumulation of these peptides in the digest of 70% polished rice samples correlated well with the crude protein content of the rice grains. The degree of accumulation of these peptides in Yamadanishiki and low-polish-rate rice was low, whereas that observed in 90% polished rice samples was extremely low.

清酒麹酵素による蒸米粒の消化物中に生じる分子量約10-30kDaの高分子量ペプチドを解析した。2次元電気泳動ゲル上の13個の主要ペプチドスポットのうち、12については、ペプチドマスフィンガープリントとMS/MS分析から、イネグルテリンのN-末端を含んでいることが明らかになった。これらのペプチドの供給源はイネグルテリンの酸性サブユニットと推定された。精製イネプロテインボディーの消化時に25%グルコースの添加によりペプチド蓄積を生じた。70%精白蒸米の消化液中の高分子ペプチドのレベルは米粒の粗タンパク質レベルと高い相関を示した。山田錦と精米歩合が低い米粒のこれらペプチドの蓄積レベルは低かったが、90%精米試料の消化物中では極めて低いレベルを示した。

掲載雑誌
J. Biosci. Bioeng. 104,251-256,2007

9 Isc1 regulates sphingolipid metabolism in yeast mitochondria Isc1は酵母ミトコンドリアのスフィンゴ脂質代謝を制御する

著者
Hiroshi KITAGAKI, L. Ashley COWART, Nabil MATMATI, Silvia VAENA DE AVALOS, Sergei A. NOVGORODOV, Youssef H. ZEIDAN, Jacek BIELAWSKI, Lina M. OBEID, Yusuf A. HANNUN
北垣浩志、コワート、マトマティ、ヴァエナドアヴァロス、ノヴォゴロドフ、ゼイダン、ビエラウスキ、オベイド、ハヌン
要約

The Saccharomyces cerevisiae inositolsphingolipid phospholipase C (Isc1p), a homolog of mammalian neutral sphingomyelinases, hydrolyzes complex sphingolipids to produce ceramide in vitro. Epitope-tagged Isc1p associates with the mitochondria in the post-diauxic phase of yeast growth. In this report, the mitochondrial localization of Isc1p and its role in regulating sphingolipid metabolism were investigated. First, endogenous Isc1p activity was enriched in highly purified mitochondria, and western blots using highly purified mitochondrial membrane fractions demonstrated that epitope-tagged Isc1p localized to the outer mitochondrial membrane as an integral membrane protein. Next, LC/MS was employed to determine the sphingolipid composition of highly purified mitochondria which were found to be significantly enriched in -hydroxylated phytoceramides (21.7 fold) relative to the whole cell. Mitochondria, on the other hand, were significantly depleted in sphingoid bases. Compared to the parental strain, mitochondria from isc1⊿ in the post-diauxic phase showed drastic reduction in the levels of -hydroxylated phytoceramide (93.1 % loss compared to WT mitochondria with only 2.58 fold enrichment in mitochondria compared to whole cell). Functionally, isc1⊿ showed a higher rate of respiratory-deficient cells after incubation at high temperature and was more sensitive to hydrogen peroxide and ethidium bromide, indicating that isc1⊿ exhibits defects related to mitochondrial function. These results suggest that Isc1p generates ceramide in mitochondria, and the generated ceramide contributes to the normal function of mitochondria. This study provides a first insight into the specific composition of ceramides in mitochondria.

出芽酵母のイノシトールスフィンゴ脂質フォスフォリパーゼC(Isc1p)は哺乳類の中性スフィンゴミエリナーゼのホモログであり、in vitroでは複合スフィンゴ脂質を分解してセラミドを生産する。エピトープでタグしたIscp1は酵母のダイオーキシックシフト後ミトコンドリアと結合する。この報告では、Isc1pのミトコンドリアへの局在と、そのスフィンゴ脂質の代謝における役割を解析した。まず、内在性のIsc1pの活性は高度に精製したミトコンドリアで高くなっており、エピトープタグしたIsc1pは膜埋め込み型のタンパク質としてミトコンドリア外膜に局在していた。次に、高度に精製したミトコンドリアのスフィンゴ脂質組成をLC/MSで調べた。その結果、高度に精製したミトコンドリアはα―ヒドロキシル化ファイトセラミドが細胞全体に比べて21.7倍に高まっており、逆にスフィンゴイド塩基は有意に減少していた。親株と比べると、ダイオーキシックシフト後のisc1破壊株のミトコンドリアはα―ヒドロキシル化ファイトセラミドが顕著に減少していた(野生株のミトコンドリアに比べて93.1%減少しており細胞全体と比べて2.58倍の濃縮に下がっていた)。機能面を調べると、isc1破壊株は高い温度で培養すると高い割合で呼吸欠損株を生じ過酸化水素やエチジウムブロマイドに感受性であったことから、isc1破壊株はミトコンドリアの機能が損傷していると考えられた。これらの結果はIsc1pはミトコンドリアでセラミドを生成しており、生成したセラミドはミトコンドリアが通常の機能を発揮するのに必要だということを示唆している。この研究はミトコンドリアに含まれるセラミドの具体的な組成に関する初めての洞察を与えるものである。

掲載雑誌
Biochem et Biophys Acta Biomembranes 1768, 2849-2861 (2007)

10 Mitochondrial dynamics of yeast during sake brewing 清酒醸造における酵母ミトコンドリアの動的構造変化

著者
Hiroshi KITAGAKI and Hitoshi SHIMOI
北垣浩志、下飯仁
要約

The presence of mitochondria during alcohol fermentation has not been studied. Here, we examined the yeast mitochondrial structure during sake brewing using the green fluorescent protein. Mitochondrial structures were observed throughout brewing and they fragmented as brewing proceeded. This study is the first to show direct evidence of the presence of mitochondria during alcohol fermentation.

アルコール醸造における酵母ミトコンドリアの存在を調べた研究はこれまでなかった。この研究で、我々は清酒醸造における酵母ミトコンドリアの構造をgreen fluorescent proteinで解析した。酵母ミトコンドリアの構造は醸造全般に渡って観察することができ、醸造が進むに従って分裂した。この研究はアルコール醸造における酵母ミトコンドリアの存在を直接示した初めての報告である。

掲載雑誌
J. Biosci. Bioeng., 104, 227-230 (2007)

11 Comparison of the Anton Paar Alcolyzer Method and the Official GC-FID Method of the National Tax Administration Agency of Japan for the Evaluation of Alcohol Content in Beer, Happo-Shu, and Nonalcoholic Beer ビール、発砲酒及びノンアルコールビールのアルコール分の測定におけるアントンパール社アルコライザー法と国税庁所定分析法のGC-FID法の比較

著者
T. Kaneko, S. Furusho, R. Ganaha, T. Inui, A. Matsuyama, A. Mizuno, M. Morimoto, K. Takemoto
金子剛、古庄重樹、我那覇隆子、乾隆子、松山暁子、水野昭博、森本真仁、竹本京子
要約
  1. The results were received from collaborators who analyzed a total of four sample pairs. The data were obtained using the Anton Paar Alcolyzer method and the GC-FID method, whichis based on the official method of the National Tax Administration Agency Japan. No outliers were identified using Dixon's ratio test, and all results were used.
  2. Based on the paired t test for the differences in the means of the alcohol content, no statistically significant difference was found between the Anton Paar Alcolyzer and GC-FID methods.
  3. Reproducibility errors of the two methods were also measured using an F test, and there was a statistical difference between the two methods. The reproducibility error of the Anton Paar Alcolyzer method (pooled variance 0.00061) was smaller than that of the GC-FID method (pooled variance 0.01882).
  1. 分析結果は、4組の試料全部を分析した共同実験者から得た。データはアントンパール社アルコライザー法と国税庁所定分析法に基づくGC-FID法を使用して得られた。Dixon's ratio testを用いて確認した結果、異常値は認めらず、全データを使用した。
  2. 一対の標本によるアルコール分析値の平均の差に関するt検定の結果、アルコライザー法とGC-FID法の間には有意差は認められなかった。
  3. 2方法の室間再現精度における分散を元にF検定を用いて比較した結果、有意差が認められた。アルコライザー法(分散:0.00061)は、GC-FID法(分散:0.01882)より高い室間再現精度を有していた。
掲載雑誌
J. Am. Soc. Brew. Chem., 65, 246-247 (2007)

2007/12/28 掲載

2. 第2四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 Stimulatory Effect of Ferulic Acid on the Production of Extracellular Xylanolytic Enzymes by Aspergillus kawachii Aspergillus kawachiiによるキシラン分解酵素生産に及ぼすフェルラ酸の促進効果

著者
Takuya Koseki, Naoko Mimasaka,Katsumi Hashizume, Yoshihito Shiono, and Tetsuya Murayama
小関卓也、美作直子、橋爪克己、塩野義人、村山哲也
要約

Production of extracellular β-1,4-xylanase, α-L- arabinofuranosidase, feruloyl esterase, and acetyl xylan esterase from Aspergillus kawachii was higher in a culture supplemented with ferulic acid than in a counterpart. Culture supernatant grown on oat spelt xylan supplemented with ferulic acid exhibited an increase in ferulic acid-releasing activity from insoluble arabinoxylan relative as compared to that from the ferulic acid-free culture.

フェルラ酸添加培地中のアスペルギルス・カワチの細胞外β-1,4-キシラナーゼ, α-L-アラビノフラノシダーゼ,フェルロイル・エステラーゼの生産は、対照と比較して高かった。フェルラ酸を添加したオートスペルトキシランの培養上清は、フェルラ酸無添加培養と比較して、不溶性アラビノキシランからのフェルラ酸遊離活性の増加を示した。

掲載雑誌
Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 1785 -1787, 2007

2 Intraspecies Diversity of the Industrial Yeast Strains Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces pastorianus Based on Analysis of the Sequences of the Internal Transcribed Spacer (ITS) Regions and the D1/D2 Region of 26S rDNA 26S rDNAの内部転写スペーサ(ITS)領域およびD1/D2領域の配列解析に基づいた工業用酵母菌株Saccharomyces cerevisiaeおよびSaccharomyces pastorianusの種内多様性

著者
KAWAHATA Miho, FUJII Tsutomu, IEFUJI Haruyuki
河畑美穂、藤井力、家藤治幸
要約

We divided industrial yeast strains of Saccharomyces cerevisiae into three groups based on the sequences of their internal transcribed spacer (ITS) regions. One group contained sake yeasts, shochu yeasts, and one bakery yeast, another group contained wine yeasts, and the third group contained beer and whisky yeasts, including seven bakery yeasts. The three groups were distinguished by polymorphisms at two positions, designated positions B and C, corresponding to nucleotide numbers 279 and 301 respectively in the S288C strain. The yeasts in the Japanese group had one thymine at position B and one thymine at position C. The wine yeasts had one thymine at position B and one cytosine at position C. And the beer and whisky yeasts had two thymines at position B and one cytosine at position C. Strains of S. pastorianus were divided into three groups based on the sequences of their 26S rDNA D1/D2 and ITS regions.

内部転写スペーサ(ITS)領域の配列に基づき工業用酵母菌株を3群に分けた。第1群は清酒酵母,焼酎酵母,および1パン酵母を含み,他の群はブドウ酒酵母を含み,第3群は7パン酵母を含むビール酵母とウイスキー酵母を含んでいる。3つの群はS288C菌株におけるそれぞれヌクレオチドナンバー279と301に相当するB位およびC位と指定した2つの位置での多型により識別できた。日本のグループの酵母は,B位に1チミンおよびC位に1チミンを有していた。ワイン酵母は,B位に2チミンおよびC位に1シトシンを有していた。S.pastorianusの菌株は,それらの26S rDNA D1/D2およびITS領域の配列に基づき3群に分割された。

掲載雑誌
Biosci Biotechnol Biochem、71、1616-1620、(2007)

3 平成17酒造年度全国新酒鑑評会出品酒の分析について Analysis of Sake Component Presented to the Sake Contest in 2005

著者
中野成美、藤田晃子、磯谷敦子、宇都宮仁、平松順一
S. Nakano, A. Fujita, H. Utsunomiya, A. Isogai, J. Hiramatsu
要約

平成17酒造年度全国新酒鑑評会の出品酒について、酒質の現状及び動向の調査研究のため、調査表の内容を集計するとともに成分分析を行った。審査は平成18年4月25日(火)から27日(木)、5月10日(水)及び11日(木)に行い、5月25日(木)に製造技術者研究会及び公開きき酒会を開催した。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告、179, 1-17 (2007)

4 第44回洋酒・果実酒鑑評会出品酒の審査結果及び分析値 Results of Sensory Evaluation and Analysis of the Western Type Alcoholic Beverages Presented to the 44th Contests

著者
三上重明、後藤奈美、小山和哉、平松順一
S. Mikami, N. Goto, K. Koyama and J. Hiramatsu
要約

本鑑評会は、国内洋酒・果実酒メーカーから任意出品された果実酒類、ウイスキー、ブランデー、スピリッツ類及びリキュール類について官能審査、化学分析を行い、品質及び技術の動向を全国的な視野で調査するとともに製造業者の参考に資することを目的として実施している。審査会は、平成18年11月 20、21日の2日間にわたり、酒類総合研究所において開催した。出品酒の官能審査と成分分析の結果の概要について報告した。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告、179, 18-33 (2007)

5 第29回本格焼酎鑑評会について Analysis of Traditional Shochu Presented to the 29th Sake Contest in 2006

著者
三上重明、福田央、佐藤雄一郎、平松順一
S. Mikami, H. Fukuda, Y. Satoh and J. Hiramatsu
要約

しょうちゅう乙類の品質を全国的な視野でとらえ、現在の製造技術の内容と酒質の傾向を把握するとともに製造業者の参考とするため、第29回本格焼酎鑑評会を平成18年6月 1日(木)及び2日(金)に独立行政法人酒類総合研究所で開催した。公開きき酒会は平成18年6月23日(金)に開催し、出品酒の官能審査と成分分析の結果の概要について報告した。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告、179, 34-43 (2007)

6 酒類および清酒粕中のアスベストと一般微生物の分析 Analysis of Asbestos and Microbes in Alcohol Beverages and Sake Cake

著者
後藤邦康
Kuniyasu GOTO
要約

市販酒類および清酒粕中のアスベストの混入を、位相差顕微鏡を用いた分散染色法により定性試験を行った。市販酒類56点(清酒28点、焼酎10点、果実酒12点、ビール6点)および清酒粕10点(当研究所製造3点含む)を調べた結果、アスベストが混入する製品はなかった。また、市販酒類について微生物の混入状況も調べたところ、一般微生物として4製造場5点に1~8cfu/mlの混入が見出された。大腸菌群および清酒(28点)のみ実施した火落菌検査につては全て陰性であった。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告、179、44-48、(2007)

(2) 取得特許

1 発酵槽及びそれを用いるビールの連続式製造法

出願番号
特許第3951028号(P3951028)
登録日
平成19年5月11日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所
発明者
井上喬、水野昭博
課題

発酵槽内での酵母の活性低下、それによる品質の低下を生じさせないビールの連続発酵システムの開発。

解決手段

発酵槽内に、凝集して沈降する性質を有する酵母が沈積可能な沈積材を、当該酵母を含む発酵未了の液が容易に沈降せず、発酵により発生し上昇する炭酸ガスにより攪拌混合されるような状態で設置し、それを間歇的に動かすことにより、沈積している酵母に、それからの離脱、再沈積を行わせることのできる、当該物体(群)を内蔵したビール醸造用発酵槽を使用することにより、活性の低下した酵母を選択的に排除することにより、槽内に高い酵母活性を維持しつつビールの連続発酵を行う。

効果

回分式発酵を連続式に転換することができれば、製品品質の変動幅の減少、それによるブレンドの必要性減少、また、バッチごとの洗浄殺菌の必要性解消等により、設備の簡略化、製品歩留まりの向上、排水処理設備への負荷低減、省力化、省エネルギー、等多くのメリットが生まれ、製造効率が大きく向上すると共に、環境への負荷も少なくすることができる。しかし、これまでその実現が阻まれてきた原因には、酵母活性の長期維持の困難性、製品品質の低下、回分式の麦汁製造と連続式の発酵との効率的連結の困難性、微生物汚染防止の困難性、などの問題があったからである。ここで発明したシステムは、これらの問題を克服し、連続発酵の諸メリットを享受できるシステムである。

2 S-アデノシルメチオニン高蓄積微生物の取得法

出願番号
特許第3972098号(P3972098)
登録日
平成19年6月22日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所
発明者
家藤治幸、庄林愛、岩下和裕
課題

ナイスタチン耐性株を選択することによるS-アデノシルメチオニン(SAM)高蓄積微生物の取得方法が提供される。具体的には、ナイスタチンを含有する選択培地で生育してくる菌株を取得すればよく、ポジティブスクリーニングによるため、効率的且つ正確に目的とする変異株を取得することができる。

解決手段

本取得方法は、酵母、特に清酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)のほか各種微生物に広く適用することができ、本法によって育種分離された変異株を大量培養することにより、SAMの大量生産が可能となる。

(3) 公開特許

1 トランスポゾンを利用した醸造用酵母の判別法

出願番号
特許出願2006-2703(P2006-2703)
出願日
2006年1月10日
公開番号
特許公開2007-97415(P2007-97415A)
公開日
2007年7月19日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所
発明者
福田央、周延、三上重明
課題

醸造用酵母の正確な判別、分類、同定を迅速且つ容易に行う方法の開発。

解決手段

トランスポゾンのL T R 領域を含むD N A 配列の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、P C R 法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を電気泳動又は制限酵素で処理した後、電気泳動し、その電気泳動パターンの違いにより酵母を判別する。その結果、醸造用酵母の正確な分類・判別が迅速且つ容易に可能になる。本法は、再現性が高く、しかも短期間に結果が得られ、清酒酵母と焼酎酵母といった異なった用途の酵母の判別を可能とするだけでなく、協会焼酎酵母S H 4 と鹿児島酵母K 2 といった同一用途の酵母間の判別も可能とする。

2 S-アデノシルメチオニンの安定化剤及び安定化方法

出願番号
特許出願2006-16595 (P2006-16595)
出願日
2006年1月25日
公開番号
特許公開2007-197346(P2007-197346A)
公開日
2007年8月9日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所
発明者
家藤治幸、浮穴えい子、藤井力、正木和夫
課題

S-アデノシルメチオニン(SAM)を安定化させる効果を有する物質を含有する安定化剤及び該物質を用いた安定化方法を提供すること。

解決手段

S-アデノシルメチオニンの安定剤は、リン酸化合物を有効成分として含有する。S-アデノシルメチオニンの安定化方法は、S-アデノシルメチオニンにリン酸化合物を添加することを含む。

効果

従来の方法よりも長期間にわたって効果的にSAMを安定化させることができる安定剤及び安定化方法が提供された。

2007/10/10 掲載

1. 第1四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 Hepatoprotective Effects of Concentrate and Components of Sake against Galactosamine (GalN)-Induced Liver Injury in Mice マウスにおける清酒濃縮物と清酒成分のガラクトサミン誘発肝障害抑制効果

著者
Hanae IZU, Kazuhisa HIZUME, Kuniyasu GOTO, and Masato HIROTSUNE
伊豆英恵、樋詰和久、後藤邦康、広常正人
要約

We investigated the hepatoprotective effects of concentrate of sake (CS) and its components against D-galactosamine (GalN)-induced liver injury by measuring plasma alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) activities in mice. CS significantly suppressed GalN-induced elevations of ALT and AST activities. Each of four concentrated fractions extracted from sake (consisting mainly of basic amino acids, neutral and acidic amino acids, organic acids or sugars, respectively) suppressed GalN-induced elevations of ALT and AST activities. We focused on the sugar fraction containing glucose and ethyl a-D-glucoside (a-EG), which is a sake-specific sugar, as major components and demonstrated that only a-EG showed significant suppression of GalN-induced elevations of ALT and AST activities. We compared the effects of a-EG analogues, methyl a-D-glucoside and ethyl b-D-glucoside, on GalN-induced liver injury and confirmed that only a-EG significantly suppressed both ALT and AST activities. Moreover, CS and a-EG suppressed GalN-induced production of IL-6 and liver DNA fragmentation. Together these results show that CS and its component, a-EG, suppressed GalN-induced liver injury through inhibition of IL-6 production.

マウスで清酒濃縮物(CS)及びアミノ酸、有機酸、糖を主成分とする清酒画分濃縮物がガラクトサミン(GalN)によるアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)の上昇を抑制していた。本研究では清酒糖画分に注目し、清酒特異的な糖成分であるα-エチルグルコシド(α-EG)が有意にGalNによるALTとASTの上昇を抑制することを明らかにした。また、α-EGは構造が類似であるα-メチルグルコシド、β-エチルグルコシドよりもGalN肝障害抑制効果が高いことを示した。CSとα-EGはGalNが誘導するIL-6産生を抑制しており、これによってGalN誘発肝障害を抑制することが示唆された。

掲載雑誌
Biosci. Biotechnol. Biochem.(2007 71(4):951-957)

2 製麹工程における清酒麹の香りの変化 Change in the aroma of sake koji during koji-making

著者
髙橋美絵、磯谷敦子、宇都宮仁、中野成美、小泉武夫、戸塚昭
Mie TAKAHASHI, Atsuko ISOGAI, Hitoshi UTSUNOMIYA, Shigeyoshi NAKANO, Takeo KOIZUMI, Akira TOTSUKA
要約

製麹工程における麹の香りの変化を明らかにするために、製麹工程中における香気の変化を官能的及び定量的に検討した。Phenylacetaldehydeは床もみ後40 時間で最大となり、1-Octen-3-one、1-Octen-3-olは出麹5時間前から出麹(床もみ後49時間)にかけて約2倍に増加し、その後も増加し続けたことから、これらの成分のバランスで栗様の香り (栗香) になるものと考察した。キノコ香については、 1-Octen-3-ol及び1-Octen-3-oneが他の成分より強いことに起因していた。1-Octen-3-olの前駆物質と考えられるリノール酸は菌体量の増加に伴って増加する傾向を示し、リノール酸は麹菌増殖の指標となると考えられた。麹から抽出した粗酵素液を基質としてリノール酸または1-Octen-3-olを含んだ緩衝液に加えたところ、1-Octen-3-olはリノール酸からリノール酸ヒドロペルオキシド(HOD)を経由して生成し、1-Octen-3-oneは1-Octen-3-olの酵素的酸化により生成することが確認された。麹の香りは麹菌の増殖シグナルであり、製麹工程管理及び麹の品質評価の指標として活用できると思われる。

In order to clarify the changes in the aroma of sake koji during koji-making, we carried out sensory analyses and quantitative analyses of aroma compounds of sake koji. The concentration of phenylacetaldehyde reached a peak 40 hours after tokomomi. On the other hand, the concentrations of 1-octen-3-ol and 1-octen-3-one doubled in the 5 hours before de-koji (49 hours after tokomomi) and continued to increase after that. It was considered that the aroma of koji was sensed as kuri-ka (chestnut-like aroma) by the balance of the concentrations of those three compounds, and it was sensed as kinoko-ka (mushroom-like aroma) when the aroma of 1-octen-3-ol and 1-octen-3-one was strong, compared with other compounds. The formation mechanisms of these aroma compounds were also investigated. The concentration of linoleic acid, which is considered a precursor of 1-octen-3-ol, increased with the mycelial growth during koji-making. It was suggested that linoleic acid could be an index of the mycelial growth in koji-making. The crude enzymes were extracted from koji and added to a buffer solution containing linoleic acid or 1-octen-3-ol as substrate. It was confirmed that 1-octen-3-ol was generated from linoleic acid via 10-hydroperoxide (HOD) and 1-octen-3-one was generated by the enzymatic oxidation of 1-octen-3-ol. As the aroma of koji was the indicator of the growth of koji, it could also serve as an index for quality control in the koji-making process.

掲載雑誌
日本醸造学会誌、102、403-411、(2007)

3 Ethanol-induced death in yeast exhibits features of apoptosis mediated by mitochondrial fission pathway. 酵母におけるエタノールによる死はミトコンドリア分裂経路を介したアポトーシスの側面を持つ

著者
Hiroshi KITAGAKI, Yoshio ARAKI, Kouichi FUNATO and Hitoshi SHIMOI
北垣浩志、荒木義雄、船戸耕一、下飯仁
要約

Cell death in yeast (Saccharomyces cerevisiae) involves several apoptotic processes. Here, we report the first evidence of the following processes, which are also characteristic of apoptosis, in ethanol-induced cell death in yeast: chromatin condensation and fragmentation, DNA cleavage, and a requirement for de novo protein synthesis. Mitochondrial fission protein, Fis1, appears to mediate ethanol-induced apoptosis and ethanol-induced mitochondrial fragmentation. However, mitochondrial fragmentation in response to elevated ethanol levels was not correlated with cell death. Further, in the presence of ethanol, generation of reactive oxygen species was elevated in mutant fis1D cells. Our characterization of ethanol-induced cell death in yeast as being Fis1-mediated apoptosis is likely to pave the way to overcoming limitations in large-scale fermentation processes, such as those employed in the production of alcoholic beverages and ethanol-based biofuels.

これまで酵母のさまざまな細胞死がアポトーシスのプロセスを持つことが報告されてきた。本報告では、エタノールによって誘導される酵母の死には、クロマチンの凝縮と断片化、DNAの分解、タンパク質の新規合成を必要とするといったアポトーシスに特徴的なプロセスが見られることを見出した。ミトコンドリアの分裂タンパク質であるFis1がエタノール誘導死とエタノール誘導ミトコンドリア分裂を制御していた。しかし、エタノールによって起きるミトコンドリアの分裂は直接的にはエタノール誘導死と関係しているわけではなかった。さらに、エタノールの存在下、fis1破壊株では活性酸素が増加していることがわかった。これらのことから、酵母におけるエタノール誘導死はミトコンドリアの分裂タンパク質であるFis1によって制御されるアポトーシスの側面を持つことが明らかとなり、酒類やエタノールをベースにした生物燃料などの大規模な生産の技術の改良に示唆を与えると考えられた。

掲載雑誌
FEBS Letters, 581, 2935-2942 (2007)

4 Influence of Maceration Temperature in Red Wine Vinification on Extraction of Phenolics from Berry Skins and Seeds of Grape (Vitis vinifera) 赤ワイン醸し発酵中のブドウ果皮及び種子よりのフェノール化合物の抽出及び発酵温度経過の影響

著者
Kazuya KOYAMA, Nami GOTO-YAMAMOTO, and Katsumi HASHIZUME
小山和哉、後藤奈美、橋爪克己
要約

The extraction of phenolics from berry skins and seeds of the grape, Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon, during red wine maceration and the influence of different temperature conditions(cold soak and/or heating at the end of maceration) were examined. Phenolics contained mainly in berry skins, i.e., anthocyanin, flavonol, and epigallocatechin units within proanthocyanidins, were extracted during the early stage of maceration, whereas those in seeds, i.e., gallic acid, flavan-3-ol monomers, and epicatechin-gallate units within proanthocyanidins, were gradually extracted. In addition to their localization, the molecular size and composition of the proanthocyanidins possibly influenced the kinetics of their extraction. Cold soak reduced the extraction of phenolics from the seeds. Heating at the end of maceration decreased the concentration of proanthocyanidins. Thus, the modification of the temperature condition during maceration affected the progress in the concentration of phenolics, resulting in the alteration of their composition in the finished wine.

醸し発酵中のカベルネソーヴィニヨン果皮及び種子からのフェノール化合物の抽出経過、並びに抽出に及ぼす温度経過の影響について検討した。果皮に由来するフラボノール、アントシアニン、果皮由来プロアントシアニジンの構成単位であるエピガロカテキンは醸し発酵に抽出されたが、主に種子に由来する没食子酸やフラバン-3-オルモノマー、プロアントシアニジンに含まれるエピカテキンガレートは除々に増加した。初期低温醸しは、種子よりのフェノール化合物の抽出を減少させた。後期高温醸しによって、プロアントシアニジン濃度は減少した。温度経過の違いは、各種フェノール化合物の抽出経過に影響し、製成酒のフェノール組成を変化させた。

掲載雑誌
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry、71、958-965、(2007)

5 Loss of anthocyanins in red-wine grape under high temperature 高温条件における赤ワイン用ブドウのアントシアニンの消失

著者
Kentaro MORI, Nami GOTO-YAMAMOTO, Masahiko KITAYAMA, Katsumi HASHIZUME
森健太郎、後藤(山本)奈美、北山雅彦、橋爪克己
要約

To determine the mechanism of inhibition of anthocyanin accumulation in the skin of grape berries due to high temperature, the effects of high temperature on anthocyanin composition and the responses in terms of gene transcript levels were examined using Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon. High temperature (maximum 35 ℃) reduced the total anthocyanin content to less than half of that in the control berries (maximum 25 ℃). HPLC analysis showed that the concentrations of anthocyanins, with the exception of malvidin derivatives (3-glucoside, 3-acetylglucoside, and 3-p-coumaroylglucoside), decreased considerably in the berries grown under high temperature as compared with the control. However, Affymetrix Vitis GeneChip microarray analysis indicated that the anthocyanin biosynthetic genes were not strongly down regulated at high temperature. A quantitative real time PCR analysis confirmed this finding. To demonstrate the possibility that high temperature increases anthocyanin degradation in grape skin, stable isotope labelled tracer experiments were carried out. Softened green berries of Cabernet Sauvignon were cut and aseptically incubated on filter paper with 1 mM aqueous L- [1-13C]phenylalanine solution for 1 week. Thereafter, the changes in 13C-labelled anthocyanins were examined under different temperatures (15, 25, and 35 ℃). In the berries cultured at 35 ℃, the content of total 13C-labelled anthocyanins that were produced before exposure to high temperature was markedly reduced as compared with those cultured at 15 ℃ and 25 ℃. These data suggest that the decrease in anthocyanin accumulation under high temperature results from factors such as anthocyanin degradation as well as the inhibition of mRNA transcription of the anthocyanin biosynthetic genes.

高温条件がアントシアニン蓄積を阻害するメカニズムを明らかにするために、ファイトトロン内でポット栽培したVitis vinifera cv. Cabernet Sauvignonを用いて、高温がアントシアニン組成と遺伝子転写産物レベルの反応に及ぼす影響を検討した。ベレゾン後4週間、最高室温35℃で栽培したブドウのアントシアニン含量は、最高25℃で栽培した対照区の半分以下に減少した。HPLC分析の結果、マルビジン系(3-グルコシド、3-アセチルグルコシド、3-p-クマロイルグルコシド)以外のアントシアニンが有意に減少した。しかし、ジーンチップ解析ではアントシアニン生合成系遺伝子は高温でもあまり強くダウンレギュレートされていなかった。リアルタイムPCR解析もこの結果を支持した。次に、高温条件がアントシアニンの分解を促進する可能性を検討するために、安定同位体トレーサー実験を行った。緑の軟化したカベルネの果粒を切り、1 mMのL-[1-13C]フェニルアラニン水溶液を含むろ紙上で無菌的に1週間培養した。その後13C-ラベルしたアントシアニンの消長を15℃、25℃、35℃で検討した。35℃の培養果粒では15℃、25℃の果粒と比較して、13C-アントシアニンが著しく減少した。これらの結果から、高温条件でのアントシアニン蓄積阻害はアントシアニン合成系遺伝子の転写抑制だけでなく、アントシアニンの分解のような他の要因も関与していることが示唆された。

掲載雑誌
Journal of Experimental Botany, 58, 1935-1945, (2007)

6 Effect of Shading on Proanthocyanidin Biosynthesis in the Grape Berry ブドウ果実におけるプロアントシアニジンの生合成に及ぼす遮光の影響

著者
A. Fujita, N. Soma, N. Goto-Yamamoto, A. Mizuno, K. Kiso, and K. Hashizume
藤田晃子、相馬紀子、後藤(山本)奈美、水野昭博、木曽邦明、橋爪克己
要約

Proanthocyanidins, which are oligomers and polymers of flavan-3-ol units (e.g., (+)-catechin and (-)-epicatechin), are important components of grapes for red winemaking. Flavan-3-ols are biosynthesized by the catalysis of anthocyanidin reductase (ANR) and leucoanthocyanidin reductase (LAR). In this study, we investigated the effect of shading on proanthocyanidin biosynthesis in berries of Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon'. Shading of the berries reduced the accumulation of proanthocyanidins and the transcription of ANR and LAR genes in the skins during berry development, while no significant effect was observed in the seeds. Because the proanthocyanidins significantly decreased in the skins and seeds of the control berries during ripening, the levels of proanthocyanidins were similar in the shaded and control berries at the harvest stage.

ロアントシアニジンは、(+)-カテキンや(-)-エピカテキンのようなフラバン-3-オール単位のオリゴマーやポリマーで、赤ワイン醸造用ブドウの重要な成分である。フラバン-3-オール類は、アントシアニジンレダクターゼ(ANR)やロイコアントシアニジンレダクターゼ(LAR)により生合成される。本研究では、ブドウ‘カベルネ・ソービニヨン'の果実におけるプロアントシアニジンの生合成に及ぼす遮光の影響を調査した。果実の遮光により、生育期の果皮においてプロアントシアニジンの蓄積とANR及びLAR遺伝子の転写が抑制された一方、種子においては顕著な影響がみられなかった。成熟期に対照区の果皮と種子でプロアントシアニジンが著しく減少したため、収穫期にはプロアントシアニジンが両区で同様のレベルになった。

掲載雑誌
J. Japan. Soc. Hort. Sci., 76 (2), 112-119 (2007)

7 The Promoter Activity of Isovaleryl-CoA Dehydrogenase-Encoding Gene (ivdA) from Aspergillus oryzae is Strictly Repressed by Glutamic Acid 麹菌Aspergillus oryzaeから単離したイソバレリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ivdA のプロモーター活性はグルタミン酸により強く抑制される

著者
Nobuo YAMASHITA, Kazutoshi SAKAMOTO Osamu YAMADA, Osamu AKITA and Akira NISHIMURA
山下伸雄、坂本和俊、山田修、秋田修、西村顕
要約

We cloned the isovaleryl-CoA dehydrogenase (IVD)-encoding gene from Aspergillus oryzae. The promoter of ivdA was subjected to β-glucuronidase (GUS) reporter assays in which certain amino acids were used as a major carbon source. L-leucine most strongly induced GUS-activity, while in the case of L-glutamate, significantly low activity was found, indicating that ivdA transcription was strongly repressed by glutamic acid.

我々は麹菌Aspergillus oryzaeからイソバレリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ivdAを単離した。ivdAのプロモーターをGUS遺伝子に連結し、数種のアミノ酸を主要炭素源として培養し、プロモーターアッセイを行った。L-ロイシンを用いた場合に最もGUS活性が高い一方で、L-グルタミンの場合には有意に活性が低いことを見出した。以上のことから、ivdAの転写はグルタミン酸により強く抑制されることが示された。

掲載雑誌
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Vol. 71 (2007), No. 6 pp.1561-1563】

8 Analysis of Expressed Sequence Tags from the Fungus Aspergillus oryzae Cultured Under Different Conditions 各種培養条件で培養された麹菌Aspergillus oryzaeからの発現配列タグの解析

著者
Takeshi AKAO, Motoaki SANO, Osamu YAMADA, Terumi AKENO, Kaoru FUJII, Kuniyasu GOTO, Sumiko OHASHI-KUNIHIRO, Kumiko TAKASE, Makoto YASUKAWA-WATANABE, Kanako YAMAGUCHI, Yoko KURIHARA, Jun-ichi MARUYAMA, Praveen Rao JUVVADI, Akimitsu TANAKA, Yoji HATA, Yasuji KOYAMA, Shotaro YAMAGUCHI, Noriyuki KITAMOTO, Katsuya GOMI, Keietsu ABE, Michio TAKEUCHI, Tetsuo KOBAYASHI, Hiroyuki HORIUCHI, Katsuhiko KITAMOTO, Yutaka KASHIWAGI, Masayuki MACHIDA, and Osamu AKITA
赤尾健、佐野元昭、山田修、明野照美、藤井香、後藤邦康、大橋-国広澄子、高瀬久美子、安川-渡邊真、山口加奈子、栗原洋子、丸山潤一、プラヴィーン・ラオ・ジュヴァディ、田中昭光、秦洋二、小山泰二、山口庄太郎、北本則行、五味勝也、阿部敬悦、竹内道雄、小林哲夫、堀内裕之、北本勝ひこ、柏木豊、町田雅之、秋田修
要約

We performed random sequencing of cDNAs from nine biologically or industrially important cultures of the industrially valuable fungus Aspergillus oryzae to obtain expressed sequence tags (ESTs). Consequently, 21 446 raw ESTs were accumulated and subsequently assembled to 7589 non-redundant consensus sequences (contigs). Among all contigs, 5491 (72.4%) were derived from only a particular culture. These included 4735 (62.4%) singletons, i.e. lone ESTs overlapping with no others. These data showed that consideration of culture grown under various conditions as cDNA sources enabled efficient collection of ESTs. BLAST searches against the public databases showed that 2953 (38.9%) of the EST contigs showed significant similarities to deposited sequences with known functions, 793 (10.5%) were similar to hypothetical proteins, and the remaining 3843 (50.6%) showed no significant similarity to sequences in the databases. Culture-specific contigs were extracted on the basis of the EST frequency normalized by the total number for each culture condition. In addition, contig sequences were compared with sequence sets in eukaryotic orthologous groups (KOGs), and classified into the KOG functional categories.

産業上有用な真菌類であるAspergillus oryzaeについて、発現配列タグ(EST)の収集を目的として、9種類の生物学的、産業的に重要な培養から得られた、DNAのランダムシークエンスを行った。その結果、21446個の生ESTから7589の非重複なコンセンサス配列(コンティグ)を得た。全コンティグのうち、5491(72.4%)はある一つの培養からのみ得られた生ESTで構成されていた。これらは4735 (62.4%)個のシングルトン(他のESTと全く重複しないもの)を含んでいた。これらのデータは、cDNAのソースに様々な培養条件を採用したことで、効率的なESTの収集が可能となったことを示している。公的データベースに対するBLAST検索を行ったところ、コンティグのうち2953 個(38.9%)が機能既知の配列に対して、また793個 (10.5%)が機能未知の仮想タンパクに対して有意な類似を示した。3843個 (50.6%)については、データベース中に類似の配列が存在しなかった。ESTの規格化した頻度情報から、培養特異的なコンティグを抽出した。加えて、コンティグの配列を真核生物オルソロググループ(KOG)の配列セットと比較することで、それらをKOGの機能カテゴリーに分類した。

掲載雑誌
DNA Res., 14, 47-57 (2007)

9 Construction and analysis of Self-cloning Sake Yeasts that Accumulate Proline プロリンを蓄積するセルフクローニング清酒酵母の作成と解析

著者
Hiroshi TAKAGI, Fumi MATSUI, Akari KAWAGYCHI, Hong WU, Hitoshi SHIMOI, Yoshito KUBO
高木博史、松井芙美、河口あかり、呉洪、下飯仁、久保義人
要約

We constructed self-cloning diploid sake yeast strains that accumulate proline. The appropriate proline level is important for its protective effect against ethanol stress in yeast cells. Sake brewed with the proline accumulating strains contained two- to three fold more proline than the sake brewed with the parent strain. It was also suggested that intracellular proline does not affect overall fermentation profiles, but reduces fermentation time in terms of ethanol production rate.

我々は、プロリンを蓄積するセルフクローニング清酒酵母を作成した。酵母細胞をエタノールストレスから保護するためには、適切なプロリン濃度が重要であった。プロリン蓄積株を用いて醸造した清酒は、親株を用いて醸造した清酒に比べて2から3倍のプロリンを含んでいた。また、細胞内のプロリンは全体的な発酵経過には影響を与えず、エタノール生産速度が上昇することで発酵期間が短縮されることが示唆された。

掲載雑誌
J. Biosci. Bioeng., 103, 377-380 (2007)

10 Effects of Accumulated S-Adenosylmethionine on Growth of Yeast Cells 酵母細胞の増殖に及ぼす蓄積したS-アデノシルメチオニンの影響

著者
M. SHOBAYASHI, T. FUJII, H. IEFUJI
庄林愛、藤井力、家藤治幸
要約

S-adenosylmethionine (SAM) accumulated in cultured yeast cells and affected growth in two ways. High levels of intracellular SAM in yeast inhibited early growth, but increased growth in medium without sources of nitrogen and sulfur. Accumulated SAM in the yeast cells was recycled as a nutritional source depending on the sulfur and nitrogen contents of the medium.

S-アデノシルメチオニン(SAM)は培養酵母細胞中に蓄積し、2つの方法で増殖に影響した。酵母における高濃度の細胞内SAMは初期増殖を阻害したが、窒素および硫黄源なしの培地で増殖を高めた。酵母細胞中の蓄積したSAMは、培地の硫黄および窒素含量に応じて栄養源として再利用された。

掲載雑誌
Biosci Biotechnol Biochem, 71(6), 1595-1597 (2007)

(2) 公開特許

1 酵母サッカロマイセス・セレビジエのゲノムワイドなDNAマーカー

出願番号
特許出願2005-272751(P2005-272751)
出願日
2005年9月20日
公開番号
特許公開2007-82431(P2007-82431A)
公開日
2007年4月5日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、月桂冠株式会社
発明者
浪瀬政宏、秦洋二、下飯仁
課題

酵母サッカロマイセス・セレビジエのゲノムDNA中に存在するマイクロサテライト多型を特定してゲノムワイドなDNAマーカーを提供する。また、このDNAマーカーを検出するためのPCRプライマーセットを提供する。

解決手段

本発明者らは、清酒酵母協会7号ゲノムのショットガンシーケンスを実施し、インターネットで公開されている実験室酵母S288Cのゲノム配列と比較することにより、繰り返し数が異なるマイクロサテライト多型が存在する場所をゲノムワイドに特定するに至った。さらに、これらの多型を示す遺伝子座を特異的に検出できるプライマーオリゴヌクレオチドを設計し、PCR増幅産物のフラグメント長の違いにより識別可能なゲノムワイドなDNAマーカーを開発した。

2 クチナーゼの産生方法及び誘導物質含有培地

出願番号
特許出願2005-287695(P2005-287695)
出願日
2005年9月30日
公開番号
特許公開2007-97415(P2007-97415A)
公開日
2007年4月19日
出願人
独立行政法人酒類総合研究所、大日本インキ化学工業株式会社
発明者
滝澤啓信、家藤治幸、正木和夫
課題

クリプトコッカス属に属する酵母を培養し、得られた培養物からクチナーゼを分離及び精製する、より効率的なクチナーゼの産生方法、及び該方法に用いる誘導物質含有培地を提供する。

解決手段

誘導物質を含む培地でクリプトコッカス(Cryptococcus)属に属する酵母を培養し、得られた培養物よりクチナーゼを分離及び精製するクチナーゼの産生方法であって、前記誘導物質が、構成脂肪酸としてリノレン酸を含む油脂であることを特徴とするクチナーゼの産生方法、及び該誘導物質を含み、クリプトコッカス属に属する酵母を培養してクチナーゼを産生するために使用される誘導物質含有培地。クリプトコッカス属に属する酵母として、クリプトコッカスエスピーエス- 2 を好適に用いる。

2007/7/5 掲載