平成28年度 研究成果

4. 第4四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 Sake yeast YHR032W/ERC1 haplotype contributes to high S-adenosylmethionine accumulation in sake yeast strains 清酒酵母型YHR032W/ERC1が清酒酵母のS-アデノシルメチオニン高蓄積に寄与する

著者
Muneyoshi Kanai, Tomoko Kawata, Yoshie Yoshida, Yasuko Kita, Takafumi Ogawa, Masaki Mizunuma, Daisuke Watanabe, Hitoshi Shimoi, Akihiro Mizuno, Osamu Yamada, Tsutomu Fujii and Haruyuki Iefuji
金井宗良、河田知子、吉田艶枝、喜多靖子、小川貴史、水沼正樹、渡辺大輔、下飯仁、水野昭博、山田修、藤井力、家藤治幸
要約

Sake yeasts are ideally suited for sake making, producing higher levels of ethanol, proliferating at lower temperatures, and producing greater levels of various aromatic components and nutrients than laboratory yeasts. To elucidate the mechanism underlying S-adenosylmethionine (SAM) accumulation in sake yeast strains compared with that in laboratory yeast strains, we performed quantitative trait locus (QTL) analysis and identified a significant QTL on chromosome VIII. Of the 165 genes mapped at 49.8 cM from the left-end DNA marker of chromosome VIII, we focused on the YHR032W/ERC1 gene, encoding a member of the multi-drug and toxin extrusion family having antiporter activity and involved in SAM accumulation and ethionine resistance. Expression of the sake yeast ERC1 haplotype (K7ERC1) in a lowand high-copy number plasmid BYΔerc1 resulted in intracellular SAM accumulation, whereas expression of the laboratory yeast ERC1 haplotype (XERC1) did not. Comparison between DNA sequences of K7ERC1 and XERC1 revealed three amino acid substitutions: S51N, V263I, and N545I. Site-directed mutagenesis revealed that the N545I frameshift mutation was responsible for the K7ERC1 phenotype. These results indicate that K7ERC1 contributes to SAM accumulation in sake yeast strains.

清酒酵母は、実験室酵母と比べて高エタノール生産性、低温増殖性等を示し清酒製造に適した酵母であるとともに、様々な香気成分及び機能性成分を生成する。我々は機能成分の中でも清酒酵母において高蓄積することが知られているS-アデノシルメチオニン(SAM)に注目し、その高蓄積機構を解明することを目的に、清酒酵母と実験室酵母の交配による量的形質遺伝子座(QTL)解析を行い、第8番染色体上にある有意なQTLを同定した。 さらに、第8番染色体のQTL近傍に存在する165個の遺伝子の中から、YHR032W/ERC1を候補遺伝子として絞り込んだ。実験室酵母のERC1破壊株(BYΔerc1)を、清酒酵母型又は実験室酵母型ERC1発現プラスミドを用いて形質転換させ、振盪培養における経時的なSAM蓄積量を分析した。結果、清酒酵母型のERC1を発現させることでSAMの蓄積が観察され、実験室酵母型ERC1を発現させてもほぼ変化が見られなかったことから、清酒酵母が持つSAM高蓄積能に、清酒酵母型ERC1が深く関与していることが示唆された。また、SAM蓄積に寄与するERC1のSNPを調べた結果、醸造用酵母と実験室酵母ERC1の塩基長の差の原因である変異(N545I)が、清酒酵母のSAM高蓄積に大きく寄与していることが示唆された。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering, 123, 8-14 (2017)

2 Analysis of the MAT1-1 and MAT1-2 Gene Ratio in Black Koji Molds Isolated from Meju Mejuから単離された黒麴菌のMAT1-1及びMAT1-2遺伝子比に関する解析

著者
Anbazhagan Mageswari, Jeong-seon Kim, Kyu-Ho Cheon, Soon-Wo Kwon, Osamu Yamada, and Seung-Beom Hong
Anbazhagan Mageswari, Jeong-seon Kim, Kyu-Ho Cheon, Soon-Wo Kwon, 山田修, and Seung-Beom Hong
要約

Aspergillus luchuensis is known as an industrially important fungal species used for making fermented foods such as awamori and shochu in Japan, makgeolli and Meju in Korea, and Pu-erh tea in China. Nonetheless, this species has not yet been widely studied regarding mating-type genes. In this study, we examined the MAT1-1 and MAT1-2 gene ratio in black koji molds (A. luchuensis, Aspergillus niger, and Aspergillus tubingensis) and in Aspergillus welwitschiae isolated from Meju, a fermented soybean starting material for traditional soy sauce and soybean paste in Korea. The number of strains with the MAT1-1 locus was 2 of 23 (A. luchuensis), 6 of 13 (A. tubingensis), 21 of 28 (A. niger), and 5 of 10 (A. welwitschiae). Fungal species A. tubingensis and A. welwitschiae showed a 1 : 1 ratio of MAT1-1 and MAT1-2 mating-type loci. In contrast, A. luchuensis revealed predominance of MAT1-2 (91.3%) and A. niger of MAT1-1 (75%). We isolated and identified 2 A. luchuensis MAT1-1 strains from Meju, although all strains for making shochu in Japan are of the MAT1-2 type. These strains may be a good resource for breeding of A. luchuensis to be used in the Asian fermented-food industry.

Aspergillus luchuensisは、日本の泡盛、焼酎、韓国のマッコリ、Mejuや中国のプーアル茶に利用されている産業上重要な糸状菌である。にもかかわるず、これまで交配型遺伝子に関する詳細な解析はなされていなかった。我々は、韓国の伝統的な醤油や味噌のスタータであるMejuから単離された黒色Aspergillusの交配型遺伝子比について解析した。興味深いことに、交配型MAT1-1遺伝子の存在割合は、Aspergillus tubingesisでは6/13、Aspergillus welwitschiaeでは5/10と1:1でであったのに対し、A. luchuensisでは2/23、Aspergillus nigerでは21/28であった。今回Mejuからはじめて単離されたA. luchuensis MAT1-1交配型遺伝子株は、黒麴菌交配育種のためのリソースとして重要である。

掲載雑誌
Mycobiology, 44, 269-276 (2016)

3 Development of a Five Factor Drinking Motive Questionnaire for Japanese (DMQ-J) 日本人における5因子からなる飲酒動機質問票(DMQ-J)の作成

著者
Sumio Imada, Isato Furumitsu and Hanae Izu
今田純雄、古満伊里、伊豆英恵
要約

In the present study, we developed a Drinking Motive Questionnaire (DMQ-J) composed of 19 items to clarify the drinking motives of Japanese adults. Exploratory factor analysis revealed the following five reliable factors or subscales of drinking motives: "Coping" (drinking to regulate or reduce internally generated negative emotions), "Enhancement" (drinking to enhance internal positive mood), "Social" (drinking to obtain positive social, and thus external, rewards), "Meal" (drinking to enjoy one's meal), and "Restraint" (reasons to restrain one's drinking). Based on analysis of DMQ-J data from 1000 light-to-moderate drinkers, males scored higher than females on the "Coping" and lower on the "Restraint" subscales, which suggests that males have a relatively unhealthy drinking style. Moreover, females scored marginally higher than males on the "Meal" subscale, which suggests that females enjoy alcohol with their meal, but not to an unhealthy degree. In terms of generational differences, "Social" motive scores decreased but "Meal" motive scores increased with increases in age, suggesting that older people drink to enhance their internal pleasure and enjoy their meals, but not to obtain social rewards.

本研究では、日本人の成人における飲酒動機を明らかにするため、19項目からなる飲酒動機質問票(DMQ-J)を作成した。探索的因子分析により、以下の5因子または下位尺度が飲酒動機を表すことがわかった:「対処性」(ネガティブな感情を制御、弱めるための飲酒)、「高揚」(ポジティブな気持ちを促進するための飲酒)、「社会性」(社会的なポジティブさや、外部からの利益を得るための飲酒)、「食事」(各人が食事を楽しむための飲酒)、「抑制性」(各人の飲酒を抑制する理由)。1000人の軽度から適度な飲酒者によるDMQ-Jデータの解析によると、下位尺度において、男性は女性よりも「対処性」の高いスコアを示し、「抑制性」の低いスコアを示した。これは男性が相対的に不健康な飲酒をしていることを示唆している。さらに、女性は男性よりもわずかに「食事」のスコアが高く、女性は不健康ではない程度で、食事とともに飲酒を楽しんでいることが示唆された。世代間の違いの観点では、年齢が増すにつれ、「社会性」のスコアが減少し、「食事」のスコアが増加しており、高齢者は社会的見返りを得るためではなく、内面的な喜びを高め、食事を楽しむために飲酒すると示唆された。

掲載雑誌
Studies in the Humanities and Sciences, 57(2), 153-162 (2017)

4 Direct activation of GABAA receptors by substances in the organic acid fraction of Japanese sake 清酒の有機酸画分中に含有される成分によるGABAA受容体の直接的活性化

著者
Hanae Izu, Kensuke Shigemori, Masaya Eguchi, Shuhei Kawane, Shouko Fujii, Yuji Kitamura, Hitoshi Aoshima, Yasue Yamada
伊豆英恵、重森健介、江口将也、河根秀平、藤井翔子、北村悠仁、青島均、山田康枝
要約

We investigated the effect of substances present in Japanese sake on the response of ionotropic γ-aminobutyric acid (GABA)A receptors expressed in Xenopus oocytes. Sake was fractionated by ion-exchange chromatography. The fraction containing organic acids (OA fraction) showed agonist activities on the GABAA receptor. OA fractions from sake were analyzed by capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry (CE-TOFMS). Of the 64 compounds identified, 13 compounds showed GABAA receptor agonist activities. Especially, L-lactic acid showed high agonist activity and its EC50 value was 37μM. Intraperitoneal injections of L-lactic acid, gluconic acid, and pyruvic acid (10, 10, and 5mg/kg BW, respectively), which showed agonistic activity on the GABAA receptor, led to significant anxiolytic effects during an elevated plus-maze test in mice.

我々はアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させたイオンチャネル型γ-アミノ酪酸(GABA)A受容体活性における清酒含有成分の影響を調べた。清酒はイオン交換クロマトグラフィーによって、分画した。有機酸画分にGABAA受容体に対するアゴニスト活性が認められた。清酒の有機酸画分をキャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析計(CE-TOFMS)で分析し、同定した64の化合物うち、13の化合物にGABAA受容体に対するアゴニスト活性が認められた。特に、L-乳酸のアゴニスト活性が高く、EC50が37μMであった。GABAA受容体に対し、アゴニスト活性を示したL-乳酸、グルコン酸、ピルビン酸(それぞれ10、10、5mg/kg体重)をマウスに腹腔内投与し、高架式十字迷路試験を行ったところ、有意な抗不安作用が認められた。

掲載雑誌
Food Chemistry, 214(1), 354-359 (2017)

5 Identification of 4-mercapto-4-methylpentan-2-one as the characteristic aroma of sake made from low-glutelin rice 低グルテリン米を用いた清酒の特徴香としての4-mercapto-4-methylpentan-2-one(4MMP)の同定

著者
Sachiko Iizuka-Furukawa, Atsuko Isogai, Kazutaka Kusaka, Tsutomu Fujii, and Yoshinori Wakai
飯塚(古川)幸子、磯谷敦子、日下一尊、藤井力、若井芳則
要約

The grassy characteristic aroma perceived in brewed sake made from low-glutelin rice (Oryza sativa L. Mizuhonoka) was examined by gas chromatography-olfactometry and gas chromatography-mass spectrometry. By comparing the odor properties and Kovats retention indices to those of standard compounds, 4-mercapto-4-methylpentan-2-one (4MMP) was found to contribute to the characteristic aroma. Sake brewing using Mizuhonoka, low-glutelin rice, and Ginohmi (a control) revealed that 4MMP concentrations in Mizuhonoka sake samples were higher than those in Gin-ohmi samples over the fermentation period. The concentration in final Mizuhonoka sake was twice that of Gin-ohmi. To investigate the mechanism of 4MMP formation, the putative precursors, 4-S-cycteinyl-4-methylpentan-2-one (cys-4MMP) and 4-S-glutathionyl-4-methylpentan-2-one (glut-4MMP), in sake and its materials (rice and koji) were analyzed by ultra-performance liquid chromatography tandem mass-spectrometry. Cys-4MMP was not detected in all samples, while glut-4MMP was present in sake and its materials. The glut-4MMP concentration in sake was lower than that in Gin-ohmi over nearly the entire fermentation period, suggesting that conversion of the precursors to 4MMP was more effective in the mash of low-glutelin rice Mizuhonoka than in Gin-ohmi. The release of 4MMP during alcoholic fermentation from a model medium containing its precursors was examined. While no 4MMP release was observed in the control (no addition), with the addition of its precursors, the release of 4MMP increased as fermentation progressed. It was suggested that 4MMP was generated from both cys- and glut-4MMP by sake yeast. The perception threshold of 4MMP in sake was determined as 1.2 ng/L.

低グルテリン米(Oryza sativa L.みずほのか)を原料として醸造した清酒で感知される特徴香を、においかぎガスクロマトグラフィーとガスクロマトグラフィー質量分析により検討した。香りの特徴とリテンションインデックスが標品と一致したことから、4-mercapto-4-methylpentan-2-one (4MMP)がこの特徴香に寄与する成分であることがわかった。低グルテリン米品種のみずほのかと対照品種として吟おうみを使用した清酒醸造試験を行い、4MMPの経時変化を比較した。みずほのかのもろみ中の4MMPはもろみ期間を通して吟おうみよりも終始多く存在し、上槽酒では、その量は2倍程度の差となった。清酒における4MMP生成機構について調べるため、もろみ及び原料(米と麹)に含まれる4MMPの前駆体の4-S-cycteinyl-4-methylpentan-2-one (cys-4MMP) と4-S-glutathionyl-4-methylpentan-2-one (glut-4MMP)を超高速液体クロマトグラフィー質量分析により分析した。清酒もろみ及び原料中にCys-4MMPは検出されなかったが、Glut-4MMPはいずれにも検出された。みずほのかのもろみ中のGlut-4MMP量は、ほぼすべてのもろみ期間で吟おうみよりも少ないことから、前駆体から4MMPへの変換効率は、みずほのかの方が吟おうみよりも高いことが示唆された。また、4MMPの前駆体を添加したモデル清酒発酵系からの4MMP生成についても検討した。前駆体を添加しない試験区では4MMPは生成しなかったが、前駆体を添加した試験区では 発酵経過に伴い4MMPが生成した。このことから、4MMPは清酒酵母によって前駆体から生成されることが示唆された。清酒における4MMPの検知閾値を求めたところ、1.2 ng/Lであった。

掲載雑誌
J. Biosci.,Bioeng., 123, 209-215 (2017)

6 黒糖焼酎及びラム酒における揮発性成分間の相関解析 Correlation analyses of the compounds in kokuto shochu and rum

著者
福田央、韓錦順
Hisashi FUKUDA and Jinshun HAN
要約

黒糖焼酎及びラムの84種類の揮発性成分間の相関解析を行った。黒糖焼酎では、脂肪酸エステルと相関性を示した成分は、アセトアルデヒド、2-ノナノン、イソアミルアルコール、β-フェネチルアルコールであり、脂肪酸エステル間の相関は全体的に高い傾向が認められた。インダストリアルラムでr2>|0.5|の相関性を示す組数は、アグリコールラムより多く、更に、その係数は、すべて正であった。また、インダストリアルラムとアグリコールラムはサトウキビ由来の糖類から造られるものの、高い相関性を示す成分の組み合わせは異なっていた。本報告では、高い相関性を示す成分の全体的傾向を考察し、ラム酒ではr2>|0.9|の相関性を示す成分を主として取り上げた。

The correlation between eighty-four volatile compounds in kokuto shochu and rum were analyzed. In kokuto shochu, the compounds to indicate a correlation with fatty acid esters were acetaldehyde, 2-nonanone, n-propyl alcohol, isoamyl alcohol, andβ-phenethyl alcohol; the correlations between fatty acid esters are generally high. In rum, the number of the correlations (r2>|0.5|) in industrial rum was more than that in agricol rum, and all of the correlation signs (r2>|0.5|) in industrial rum were positive. In this report, the overall trend of the compounds showing a high correlation were given consideration, and the compounds showing a higher correlation (r2>|0.9|) in rum are primarily mentioned.

掲載雑誌
日本醸造協会誌 112, 35-76 (2017)

7 Cellular responses to the expression of unstable secretory proteins in the filamentous fungus Aspergillus oryzae 糸状菌 Aspergillus oryzae における不安定な分泌タンパク質発現に対する細胞応答

著者
un-ichi Yokota, Daisuke Shiro, Mizuki Tanaka, Yasumichi Onozaki, Osamu Mizutani, Dararat Kakizono, Sakurako Ichinose, Tomoko Shintani, Katsuya Gomi, Takahiro Shintani
横田淳一、城大介、田中瑞己、小野崎保通、水谷治、柿薗ダララット、一瀬桜子、新谷智子、五味勝也、新谷尚弘
要約

Filamentous fungi are often used as cell factories for recombinant protein production because of their ability to secrete large quantities of hydrolytic enzymes. However, even using strong transcriptional promoters, yields of nonfungal proteins are generally much lower than those of fungal proteins.

Recent analyses revealed that expression of certain nonfungal secretory proteins induced the unfolded protein response (UPR), suggesting that they are recognized as proteins with folding defects in filamentous fungi. More recently, however, even highly expressed endogenous secretory proteins were found to evoke the UPR.

These findings raise the question of whether the unfolded or misfolded state of proteins is selectively recognized by quality control mechanisms in filamentous fungi. In this study, a fungal secretory protein (1,2-α-D-mannosidase; MsdS) with a mutation that decreases its thermostability was expressed at different levels in Aspergillus oryzae. We found that, at moderate expression levels, wild-type MsdS was secreted to the medium, while the mutant was not. In the strain with a deletion for the hrdA gene, which is involved in the endoplasmic reticulum-associated degradation pathway, mutant MsdS had specifically increased levels in the intracellular fraction but was not secreted. When overexpressed, the mutant protein was secreted to the medium to a similar extent as the wild-type protein; however, the mutant underwent hyperglycosylation and induced the UPR. Deletion of α-amylase (the most abundant secretory protein in A. oryzae) alleviated the UPR induction by mutant MsdS overexpression. These findings suggest that misfolded MsdS and unfolded species of α-amylase might act synergistically for UPR induction.

加水分解酵素を大量に分泌できる能力を持つために、糸状菌は、しばしば組み換えタンパク質生産の細胞工場として使用される。近年の解析で特定の非菌類の分泌タンパク質の発現が、小胞体ストレス応答(UPR)を誘発することが示され、糸状菌内でフォールディング欠損タンパク質と認められることが示唆されている。しかしながら、より最近では、高度に発現した内在性分泌タンパク質でさえ、UPR を引き起こすことが明らかとなった。これらの調査結果は、タンパク質のアンフォールドかミスフォールド状態が糸状菌による品質管理メカニズムによって選択的に認識されるかどうかの疑問を引き起こす。本研究では、熱安定性が減少した真菌の変異分泌タンパク質(1,2-α-D-マンノシダーゼ; MsdS)を麹菌において異なるレベルで発現させた。しかし、強力な転写プロモーターを利用しても、非菌類のタンパク質の収率は、通常、菌類のタンパク質の収率より非常に低かった。我々は、適度な発現レベルにおいて、野生型 MsdS が培地中に分泌し、変異体はされないことを見出した。小胞体関連分解経路に関与する hrdA 遺伝子欠損株において、変異 MsdS は、分泌はなされないが、細胞内画分において特異的に増加した。過剰発現時には、変異タンパク質は、野生型タンパク質と同程度、培地中に分泌さたが、変異体は、高糖鎖付加を経て、UPR を誘発した。α-アミラーゼ(A. oryzaeで最も大量の分泌タンパク質)の欠失は、変異 MsdS 過剰発現によってUPR誘導を軽減した。これらの結果は、ミスフォールドされた MsdS とα-アミラーゼのアンフォールド体がUPR誘導のために相乗作用で行っているかもしれないことを示唆している。

掲載雑誌
Appl Microbiol Biotechnol.101(6):2437-2446, 2017

8 Detailed analysis of targeted gene mutations caused by the Platinum-Fungal TALENs in Aspergillus oryzae RIB40 strain and a ligD disruptant 麴菌野生株 (RIB40) 及び ligD 破壊株における Platinum-Fungal TALENs によって引き起こされるターゲット遺伝子変異の詳細解析

著者
Osamu Mizutani1, Takayuki Arazoe, Kenji Toshida1, Risa Hayashi1, Shuichi Ohsato, Tetsushi Sakuma, Takashi Yamamoto, Shigeru Kuwata, Osamu Yamada
水谷治、荒添貴之、利田賢次、林梨咲、大里修一、佐久間哲史、山本卓、桑田茂、山田修
要約

Transcription activator-like effector nucleases (TALENs), which can generate DNA double-strand breaks at specific sites in the desired genome locus, have been used in many organisms as a tool for genome editing. In Aspergilli, including Aspergillus oryzae, however, the use of TALENs has not been validated. In this study, we performed genome editing of A. oryzae wild-type strain via error of nonhomologous end-joining (NHEJ) repair by transient expression of high-efficiency Platinum-Fungal TALENs (PtFg TALENs). Targeted mutations were observed as various mutation patterns. In particular, approximately half of the PtFg TALEN-mediated deletion mutants had deletions larger than 1 kb in the TALEN-targeting region. We also conducted PtFg TALEN-based genome editing in A. oryzae ligD disruptant (ΔligD) lacking the ligD gene involved in the final step of the NHEJ repair and found that mutations were still obtained as well as wild-type. In this case, the ratio of the large deletions reduced compared to PtFg TALEN-based genome editing in the wild-type. In conclusion, we demonstrate that PtFg TALENs are sufficiently functional to cause genome editing via error of NHEJ in A. oryzae. In addition, we reveal that genome editing using TALENs in A. oryzae tends to cause large deletions at the target region, which were partly suppressed by deletion of ligD.

ゲノム上の任意の位置に DNA 2 本鎖切断を引き起こす Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) は、多くの生物において、ゲノム編集のツールとして使用されている。しかしながら、麴菌を含む Aspergillus 属では、TALENs の使用は、検証されていない。そこで、我々は、糸状菌コドン使用頻度に最適化された高活性型 Platinum-Fungal TALENs を用いて非相同末端結合 (Nonhomologous end-joining : NHEJ) 修復エラーを引き起こすコンストラクトで麴菌野生株のゲノム編集を行った。その結果、ターゲット変異に様々な変異パターンが観察された。特に、PtFg TALEN を介した欠失変異株の約半分程度において、1 kb 以上もの大規模欠失が認められた。我々はまた、NHEJ の末端結合に必要な ligD 遺伝子破壊株において、PtFg TALENs を用いたゲノム編集を行い、野生株と同程度の変異体が得られることを見出した。また、野生株と比較して、大規模欠失の割合が減少した。結論として、我々は、麴菌において、NHEJ 修復エラーを介してゲノム編集を引き起こすのに、PtFg TALENs は十分機能的であることを示した。加えて、麴菌で TALENs を用いたゲノム編集は、ターゲット領域の大規模欠失を引き起こしやすく、そして、それは ligD 遺伝子欠失によって部分的に抑制されることを明らかにした。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering 123(3):287-293, 2017

9 Method for the isolation of citric acid and malic acid in Japanese apricot liqueur for carbon stable isotope analysis 炭素安定同位体比分析のための梅酒に含まれるクエン酸及びリンゴ酸の単離方法

著者
Fumikazu Akamatsu, Tomokazu Hashiguchi, Yuri Hisatsune, Takaaki Oe, Takafumi Kawao, Tsutomu Fujii
赤松史一、橋口知一、久常有里、大江孝明、川尾尚史、藤井力
要約

A method for detecting the undeclared addition of acidic ingredients is required to control the authenticity of Japanese apricot liqueur. We developed an analytical procedure that minimizes carbon isotope discrimination for measurement of theδ13C values of citric and malic acid isolated from Japanese apricot liqueur. Our results demonstrated that freeze-drying is preferable to nitrogen spray-drying, because it does not significantly affect theδ13C values of citric acid and results in smaller isotope discrimination for malic acid. Both 0.1% formic acid and 0.2% phosphoric acid are acceptable HPLC mobile phases for the isolation of citric and malic acid, although theδ13C values of malic acid exhibited relatively large variation compared with citric acid following isolation using either mobile phase. The developed procedure allows preciseδ13C measurements of citric and malic acid isolated from Japanese apricot liqueur.

梅酒の信頼性確保のため、酸味料添加を検出する方法が求められている。我々は、梅酒からクエン酸及びリンゴ酸を最小の同位体分別で単離し、それらのδ13C値を測定する手法を開発した。凍結乾燥処理は、クエン酸のδ13C値に影響を及ぼさず、リンゴ酸では窒素吹き付け処理よりも同位体分別が小さくなることを示した。HPLCによるクエン酸とリンゴ酸の単離処理では、リンゴ酸のδ13C値はクエン酸のδ13C値よりもばらつきが大きかったが、0.1%ギ酸水溶液と0.2%リン酸水溶液のどちらも溶離液として利用可能である。開発した一連の手法は、梅酒から単離したクエン酸とリンゴ酸のδ13C値を正確に測定することが可能である。

掲載雑誌
Food Chemistry, 217, 112-116 (2017)

10 Polyphenolic diversity and characterization in the red-purple berries of East Asian wild Vitis species 東アジア野生ブドウ果実におけるポリフェノールの多様性と特徴

著者
Kazuya Koyama*, Hiroshi Kamigakiuchi, Kazuhiro Iwashita, Ryosuke Mochioka and NamiGoto-Yamamoto
小山和哉、上垣内宏司、岩下和裕、望岡亮介、後藤奈美
要約

Grapes (Vitis spp.) produce diverse polyphenolic compounds, which are phytochemicals that contribute to human health. In this study, the polyphenolic profiles of the red-purple berries of two wild grape species native to Japan, Vitis ficifolia and V. coignetiae, and their interspecific hybrid cultivars were investigated and compared with the profiles of V. vinifera and V. × labruscana cultivars. Proanthocyanidins (PAs) were present at lower concentrations in both skins and seeds of wild grape species and their hybrid cultivars than those in V. vinifera cultivars. They also differed in their composition, consisting mainly of epicatechin in wild grape species, but containing considerable amounts of both epigallocatechin in the skins and epicatechin gallate in the seeds of V. vinifera. In contrast, V. ficifolia varieties and their hybrid cultivars accumulated high concentrations of diverse anthocyanins, and whose compositions of anthocyanins and flavonols differed between species in their degree of modification by glucosylation, acylation, methylation and B-ring hydroxylation. Principal component analysis (PCA) indicated that the polyphenolic constituents clearly separate V. vinifera and V. × labruscana cultivars from the wild grape species as well as between wild grape species, V. coignetiae and V. ficifolia. Intermediate compositions were also observed in the hybrid cultivars between these wild grape species and V. vinifera.

ブドウは多様なポリフェノールを産生するが、これらは、人の健康にも寄与する機能性成分である。本研究では、日本在来野生ブドウである、ヴィティス・フィシフォリア、ヴィティス・コイグネティア、及びそれらの種間交雑栽培品種の果実中のポリフェノール組成について調査を行い、欧州系品種及びアメリカ系交配品種のプロファイルと比較を行った。野生種及び種間交雑品種の種子及び果皮におけるプロアントシアニジン(PA)の濃度は欧州系品種よりも顕著に低かった。また、その組成においても違いがみられ、野生種のPAは主に単一のエピカテキンユニットより構成されるのに対して、欧州系品種では、果皮PA中にエピガロカテキン、種子PA中にガロイル化された構成ユニットを多く含有していた。一方で、ヴィティス・フィシフォリア及びその種間交雑品種では果皮に多量かつ多様なアントシアニンを含有していた。アントシアニン及びフラボノールは、グルコシル化、アシル化、メチル化、及びフラボノイドB環の水酸化の程度の違いなど品種間におけるその組成は特徴的に異なっていた。ポリフェノール成分による主成分解析の結果、野生種は欧州系品種、アメリカ系交配品種とスコアプロット上において明白に分離した。また、野生種中ではヴィティス・フィシフォリア及びヴィティス・コイグネティアが分離を示したことから、特徴的なポリフェノールプロファイルを示すことがわかった。さらに、これらの野生ブドウと欧州系品種との種間交雑品種は中間的な組成を示した。

掲載雑誌
Phytochemistry, 134, 78-86, 2017

2017/4/18 掲載

3. 第3四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 Stimulating S-adenosyl-L-methionine synthesis extends lifespan via activation of AMPK S-アデノシルメチオニン合成を刺激することでAMPKを介し寿命が延長する

著者
Takafumi Ogawa, Ryohei Tsubakiyama, Muneyoshi Kanai, Tetsuya Koyama, Tsutomu Fujii, Haruyuki Iefuji, Tomoyoshi Soga, Kazunori Kume, Tokichi Miyakawa, Dai Hirata, and Masaki Mizunuma
小川貴史、椿山諒平、金井宗良、小山哲也、藤井力、家藤治幸、曽我朋義、久米一規、宮川都吉、平田大、水沼正樹
要約

Dietary restriction (DR), such as calorie restriction (CR) or methionine (Met) restriction, extends the lifespan of diverse model organisms. Although studies have identified several metabolites that contribute to the beneficial effects of DR, the molecular mechanism underlying the key metabolites responsible for DR regimens is not fully understood. Here we show that stimulating S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) synthesis extended the lifespan of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. The AdoMet synthesis-mediated beneficial metabolic effects, which resulted from consuming both Met and ATP, mimicked CR. Indeed, stimulating AdoMet synthesis activated the universal energy-sensing regulator Snf1, which is the S. cerevisiae ortholog of AMP-activated protein kinase (AMPK), resulting in lifespan extension. Furthermore, our findings revealed that S-adenosyl-L-homocysteine contributed to longevity with a higher accumulation of AdoMet only under the severe CR (0.05% glucose) conditions. Thus, our data uncovered molecular links between Met metabolites and lifespan, suggesting a unique function of AdoMet as a reservoir of Met and ATP for cell survival.

カロリー制限及び必須アミノ酸の一種であるメチオニンを制限すると寿命が延長すすることが知られている。しかし、代謝産物と食餌制限との関連や代謝産物によるアンチエイジングの詳しい仕組みは不明な点が多い。

そこで、本論文では、メチオニン代謝に異常のある変異株の寿命が短命であることを見出し、この性質を利用して逆に長寿となる変異株の取得を試みた。その結果、通常の酵母の最大寿命は12日程度だが、20日程度まで寿命が延長した変異株の取得に成功した(長寿に関与する遺伝子をSSG1と命名)。SSG1変異株の代謝について調べたところ、メチオニン代謝産物であるSAMやSAHが高蓄積していた。また、遺伝子操作によりSAM量を増加させる実験を試みたところ、メチオニンやATPが消費され、寿命が1.6倍程度延長し、既知の長寿遺伝子AMPKの機能がONになっていた。これらの事実から、SSG1変異による長寿はメチオニンやATP量の減少が鍵となっていることが支持された。さらに、SSG1変異株の遺伝子変化についてもDNAマイクロアレイ法で網羅的に調べた結果、カロリー制限で観察される遺伝子発現のパターンと類似していることも見出した。以上の結果から、本寿命延長メカニズムはカロリー制限などの食餌制限を模倣していることがわかった。

掲載雑誌
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 113, 11913-11918 (2016)

2 Defective quiescence entry promotes the fermentation performance of bottom-fermenting brewer's yeast 下面発酵ビール酵母において休止期移行の欠損が発酵能を促進する

著者
Mayu Oomuro, Taku Kato, Yan Zhou, Daisuke Watanabe, Yasuo Motoyama, Hiromi Yamagishi, Takeshi Akao T, and Masayuki Aizawa
大室繭、加藤拓、周延、渡辺大輔、本山靖朗、山岸裕美、赤尾健、相澤正幸
要約

One of the key processes in making beer is fermentation. In the fermentation process, brewer's yeast plays an essential role in both the production of ethanol and the flavor profile of beer. Therefore, the mechanism of ethanol fermentation by of brewer's yeast is attracting much attention. The high ethanol productivity of sake yeast has provided a good basis from which to investigate the factors that regulate the fermentation rates of brewer's yeast. Recent studies found that the elevated fermentation rate of sake Saccharomyces cerevisiae species is closely related to a defective transition from vegetative growth to the quiescent (G0) state. In the present study, to clarify the relationship between the fermentation rate of brewer's yeast and entry into G0, we constructed two types of mutant of the bottom-fermenting brewer's yeast Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70: a RIM15 gene disruptant that was defective in entry into G0; and a CLN3△PEST mutant, in which the G1 cyclin Cln3p accumulated at high levels. Both strains exhibited higher fermentation rates under high-maltose medium or high-gravity wort conditions (20o Plato) as compared with the wild-type strain. Furthermore, G1 arrest and/or G0 entry were defective in both the RIM15 disruptant and the CLN3△PEST mutant as compared with the wild-type strain. Taken together, these results indicate that regulation of the G0/G1 transition might govern the fermentation rate of bottom-fermenting brewer's yeast in high-gravity wort.

ビール製造のキープロセスのひとつは発酵である。ビール酵母は、発酵工程におけるエタノール生成と香味プロファイルの形成の両者について、必要不可欠な役割を担っている。したがって、ビール酵母によるエタノール発酵のメカニズムには大きな関心が寄せられている。清酒酵母の高エタノール生成能に関する知見は、ビール酵母の発酵速度を調節する要因の研究に際して優れた基盤を提供した。最近の研究から、清酒用のSaccharomyces cerevisiaeの菌株における発酵速度の亢進には、栄養増殖から静止期(G0期)への移行の欠損が密接に関わっていることが明らかになっている。本研究において、ビール酵母の発酵速度とG0期移行との間の関連を明らかにするため、著者らは下面発酵ビール酵母Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70株の2種類の変異株(G0期移行に欠損を有するRIM15遺伝子破壊株及びG1期サイクリンCln3pが細胞内に高レベルで蓄積したCLN3△PEST株)を造成した。いずれの菌株も、高マルトース培地や高濃度麦汁(20o Plato)の条件下で、親株と比較してより高い発酵速度を示した。さらに、RIM15破壊株とCLN3△PEST変異株のいずれにおいても、親株と比較して、G1期停止及び(または)G0期移行の遅延が見られた。以上をまとめると、これらの結果はG0期G1期の転換の調節は、高比重麦芽における下面発酵ビール酵母の発酵速度に影響を及ぼすことを示している。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering, 122, 577-582 (2016)

3 The relationship between rice protein composition and nitrogen compounds in sake 米のタンパク質組成と清酒中の窒素化合物との関連

著者
Masaki Okuda, Minami Miyamoto, Midori Joyo, Kei Takahashi, Nami Goto-Yamamoto, Shuichi Iida and Takuro Ishii
奥田将生、宮本南、上用みどり、高橋圭、後藤奈美、飯田修一、石井卓朗
要約

The relationship between the protein composition of rice and nitrogen compounds (amino acids and oligo-peptides) in the produced sake were investigated using endosperm protein mutant rice (LGC-1, LGC-Jun, Kx433, QA28), sake rice (Yamadanishiki) and cooking rice (Nipponbare, Nihonmasari, Koshihikari). The total nitrogen concentration, amino acid concentration and most peptide peak areas determined by RP-HPLC and gel filtration chromatography of the produced sake were lower when sake was made from a low glutelin content rice mutant compared with other rice varieties. The concentration of nitrogen compounds in the sake positively correlated with the glutelin content of the highly milled rice grains used for sake production. Sake produced using a low glutelin content rice mutant is generally evaluated as having a light taste. Our findings suggest that nitrogen compounds (oligo-peptides and amino acids) derived from rice glutelin significantly contribute to the taste of sake.

貯蔵タンパク質変異体米(LGC-1、LGC-Jun、K×433、QA28)及び酒造好適米(山田錦)、食用米(日本晴、ニホンマサリ、コシヒカリ)を用いて、胚乳貯蔵タンパク質の組成と製成酒のアミノ酸やペプチドなどの窒素化合物の関係性について検討した。貯蔵タンパク質変異体米を用いて製造した清酒の全窒素含量、アミノ酸含量及びRP-HPLCやゲル濾過クロマトで解析したペプチドは、通常品種と比較して低かった。製成酒中の窒素化合物含量は、グルテリン含量と高い正の相関がみられた。グルテリン含量の低い米を使用した清酒は一般的に軽快な呈味となる。本研究で得られた知見から、米のグルテリンに由来するペプチドやアミノ酸が清酒の呈味に寄与する可能性が示唆された。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering, 122, 70-78 (2016)

4 Transfer of caesium and potassium from Japanese apricot (Prunus mume Sieb.et Zucc.) to Japanese apricot liqueur (Ume liqueur) セシウム及びカリウムの梅果実から梅酒への移行

著者
Masaki Okuda, Takeshi Akao, Masanori Sumihiro, Megumi Mizuno and Nami Goto-Yamamoto
奥田将生、赤尾健、住広 匡謙、水野恵、後藤奈美
要約

The potential contamination with radionuclides released by the Fukushima Daiichi Nuclear Power Plant Accident following the great east Japan earthquake and tsunami in March 2011 of agricultural products and processed foods derived from them is a matter of on-going concern. The stable 133Cs is a useful indicator for predicting the behaviour of radioactive Cs, and potassium (K) is a congener of Cs. In this study, the distribution of 133Cs and K in Ume fruit, and the transfer of 133Cs and K from Ume fruit to Ume liqueur, were investigated. The concentrations of 133Cs and K in Ume fruit were highest in the skin, followed by the kernel or flesh, and then the pit. About 80% of 133Cs and K in all Ume fruits was distributed in the flesh. The transfer ratios of 133Cs and K from Ume fruit to Ume liqueur were similar among all cultivars after 3months, and they were similar to those of organic acids. The food retention factor (Fr = weight of 133Cs in Ume liqueur/weight of 133Cs in Ume fruit) was ca. 0.8, and the processing factor (Pf = concentration of 133Cs in Ume liqueur/concentration of 133Cs in Ume fruit) was 0.2-0.3. From the present study, the radioactivity of Ume liqueur would be below the legal limit if made using Ume fruits within the legal limit, thereby confirming the safety of Ume liqueur.

東日本大震災に伴う福島第一原子力発電所事故により放出された放射性物質の汚染が農産物及びその加工食品において懸念されてきた。非放射性133Csは放射性Csの挙動を予測するために有効であり、またKはセシウムの同族元素である。本研究では、非放射性133CsとKについて梅果実における分布及び梅果実から梅酒への移行を解析した。梅果実中の133Cs及びKは、果皮、仁、果肉、種子の外殻の順に濃度が高かった。梅果実中の133Csは約80%が果肉に存在した。133Cs及びKの原料梅から梅酒への移行率は、移行仕込み3ヶ月後において全ての品種で同様で、有機酸の梅果実から梅酒への移行と類似していた。原料梅中の133Cs の梅酒への残存率は(Food retention factor = Fr = 梅酒中の133Cs量/原料梅133Cs 量)は、平均して0.8であった。原料梅と梅酒の濃度比 (加工係数 = Processing factor = Pf = 梅酒133Cs濃度/原料梅133Cs濃度) は、0.2~0.3であった。以上より、基準値内の梅を用いれば梅酒は基準値を超えることなく安全であることが確認された。

掲載雑誌
Journal of the Institute of Brewing, 122, 473-479 (2016)

5 Candida easanensis strain JK-8 β-glucosidase: a glucose-tolerant enzyme with high specific activity for laminarin Candida easanensis JK-8株のβグルコシダーゼ:ラミナリンに高い比活性を持つ耐糖性酵素

著者
Jantaporn Thongekkaew, Tsutomu Fujii, Kazuo Masaki
Jantaporn Thongekkaew、藤井力、正木和夫
要約

Thermotolerant yeasts, Candida easanensis strain JK-8 secreted a β-glucosidase when grown in liquid media containing various carbon sources. The greatest enzyme activity was found in medium containing 1% cellobiose as a sole carbon source. An extracellular β-glucosidase was purified to homogeneity by anion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The molecular weight (Mw) of the β-glucosidase was estimated to be 48 kDa by SDS-PAGE. The optimal activity was at pH 4.5-5.5 and 60℃. The purified enzyme was stable in the pH range of 4.0-6.0 and had a 2 h half life at 50℃. The presence of metal ions (Ca2+, Mn2+, Zn2+ and Cu2+), mercaptoethanol and EDTA at 5 and 10 mM positively influenced its activity. It showed high specific activity for p-nitrophenyl-β-glucopyranoside (p-β-NPG) and laminarin. The similar Vmax of 10 μmol min-1mg protein-1 was found in both p-β-NPG (Km value of 5 mM) and laminarin (Km value of 5 mg mL-1). The enzyme displayed high tolerance to glucose with a Ki of 1.3 M and it was tolerant in the presence of methanol and ethanol at concentration up to 15%.

耐熱性酵母Candida easanensis JK-8株は、様々な炭素源を含む液体培地で増殖すると、β-glucosidaseを分泌する。最も高い酵素活性は、1%セロビオースを唯一の炭素源とした時に見られた。陰イオン交換クロマトグラフィーと疎水性クロマトグラフィーにより菌体外β-glucosidaseを精製した。β-glucosidaseのSDS-PAGEでの分子量(Mw)は48 kDaで、至適pHは4.5-5.5、至適温度は60℃であった。精製酵素は、pH4.0-6.0において安定で、50℃での半減期は2時間であった。金属イオン(Ca2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+)や5 mMメルカプトエタノール、10 mM EDTAの存在は、酵素活性に正の影響を与えた。p-nitrophenyl-β-glucopyranoside (p-β-NPG)やラミナリンに対し高い比活性を示した。10 μmol min-1mg protein-1のVmaxを示したのは、p-β-NPG (Km値は5 mM) とlaminarin (Km値は5 mg mL-1)の両方それぞれに対してであった。本酵素はグルコースに対するKiが1.3 Mと高い耐性を示し、15%までの濃度のエタノールやメタノールに対して耐性を示した。

掲載雑誌
Current Chemical Biology, 10, 117-126 (2016)

6 清酒酵母及び焼酎酵母のフェルラ酸脱炭酸能とそれに必要な遺伝子PAD1及びFDC1の一塩基多型 Ferulic acid decarboxylation ability and single nucleotide polymorphisms of PAD1 and FDC1 among sake yeasts and shochu yeasts

著者
向井伸彦、福家成美、正木和夫、山田修、家藤治幸
Nobuhiko MUKAI, Narumi FUKE, Kazuo MASAKI, Osamu YAMADA and Haruyuki IEFUJI
要約

我々は以前、酵母Saccharomyces cerevisiaeのフェルラ酸脱炭酸反応にはPAD1 (phenylacrylic acid decarborxylase gene, YDR538W)、FDC1 (ferulic acid decarboxylase gene, YDR539W)両遺伝子が必須であること及び醸造用酵母のフェルラ酸脱炭酸能は、両遺伝子の一塩基多型と関連がみられることを示した。本報では、現在では利用されなくなった株も含め様々な清酒酵母及び焼酎酵母のフェルラ酸脱炭酸能とPAD1FDC1両遺伝子配列を調べた。その結果、以前明らかにした株も含め清酒酵母15株及び焼酎酵母14株はすべてフェルラ酸脱炭酸能がみられなかった。清酒酵母及び焼酎酵母のPAD1FDC1配列は非常に類似していた。PAD1FDC1の一塩基多型を基にすると清酒酵母はK-1型(K-1、K-3、K-4、K-5、K-8、RIB0001、RIB0006、RIB0007)、K-6型(K-6、K-7、K-9、K-10、K-12、K-13)の2種類に分かれた。K-2に関しては、複数配列が存在しており、遺伝子型を決定できなかった。また、焼酎酵母はK-1型(KS-3、MK021、Heisei Miyazaki、K2)、K-6型(KS-4)、KS-2型(KS-2、S-2、SH-4、C4)、BY19901型(BY19901、BY19902、BY19903、H5)及びAwamori-101型(Awamori-101)の5種類に分かれた。清酒酵母及び焼酎酵母は初期に選抜された酵母からフェルラ酸脱炭酸能を有していない株が使用されていることが明らかとなった。PAD1FDC1配列は清酒酵母及び焼酎酵母を識別するためのマーカーとして非常に重要である。

We have previously reported that PAD1 (phenylacrylic acid decarborxylase gene, YDR538W) and FDC1 (ferulic acid decarboxylase gene, YDR539W) genes are essential for decarboxylation of ferulic acid in Saccharomyces cerevisiae and that the single polymorphisms of both genes show a positive relationship with ferulic acid decarboxylation ability among industrial yeasts used in alcoholic beverage production. In this paper, we examined the decarboxylation ability of the ferulic acid of various sake yeasts and shochu yeasts including strains which are not used industrially at the present time. Results showed that all 15 sake yeasts and 14 shochu yeasts did not have a ferulic acid decarboxylation ability. The sequences of PAD1 and FDC1 genes among sake yeasts and shochu yeasts were very similar. Sake yeasts were classified in two types based on single nucleotide polymorphisms of PAD1 and FDC1 genes: a K-1 type (K-1, K-3, K-4, K-5, K-8, RIB0001, RIB0006 and RIB0007) and a K-6 type (K-6, K-7, K-9, K-10, K-12 and K-13). With respect to K-2, plural sequences coexisted and were not able to determine genotype. Shochu yeasts were divided into five types based on single nucleotide polymorphisms: a K-1 type (KS-3, MK021, Heisei Miyazaki and K2), a K-6 type (KS-4), a KS-2 type (KS-2, S-2, SH-4, C4), a BY19901 type (BY19901, BY19902, BY19903 and H5), and an Awamori-101 type (Awamori-101). Our findings indicate that sake yeasts and shochu yeasts have been selected for brewing strains which do not have the ability of decarboxylation of ferulic acid from an early stage of the selection. PAD1 and FDC1 genes are very important as markers to distinguish sake yeasts and shochu yeasts from other yeasts for alcoholic beverage production.

掲載雑誌
日本醸造協会誌, 111(10), 679-685 (2016)

7 泡盛中の1-オクテン-3-オールの由来と蒸留の挙動 The origin and distillation behavior of 1-octen-3-ol in Awamori

著者
福田央、韓錦順
Hisashi FUKUDA and Jinshun HAN
要約

泡盛及びそれ以外の焼酎では、1-オクテン-3-オールとサリチル酸メチルの含量が大きく異なっており、特に1-オクテン-3-オールは泡盛に多い成分である。1-オクテン-3-オールは、白麹の醪及び白麹と蒸米による醪の蒸留液より、黒麹の醪の留液で高かった。また、蒸留での挙動を調べたところ、低沸点であるカプロン酸エチルと同様の傾向が認められた。泡盛の1-オクテン-3-オールが他の焼酎に比べて多い理由は、泡盛製造で黒麹を使用することにあると考えられ、常圧蒸留だけでなく減圧蒸留でも比較的多い理由は、その揮発性が反映していると推定された。

There is conspicuously different in 1-octen-3-ol and methyl salicylate concentration between Awamori and the other shochu. Especially, the concentration of 1-octen-3-ol in Awamori is higher than that of the other shochu. This compound concentration is higher in distilled solution of moromi made from black koji than that of moromi made from white koji and momori made from white koji and steamed rice. In the distillation process, the behavior of 1-octen-3-ol is similar to that of ethyl caproate. The main reason that the concentration of 1-octen-3-ol is higher in Awamori than in the other shochu is considered that awamori making use for black koji, and 1-octen-3-ol with comparatively high concentration contained in vacuum distillations as well as atmospheric distillations is estimated to depend on its volatility.

掲載雑誌
日本醸造協会誌, 111 (11), 750-757 (2016)

8 米焼酎・麦焼酎の揮発性成分組成と成分間の相関解析 Characteristics of volatile compositions and a correlation analysis of the compounds in rice shochu and barley shochu.

著者
福田央、韓錦順、水谷治、金井宗良、山田修
Hisashi FUKUDA, Jinshun HAN, Osamu MIZUTANI, Muneyoshi KANAI and Osamu YAMADA
要約

焼酎の84種類の揮発性成分をSPME法とヘッドスペース法を用いて分析した。米焼酎・麦焼酎とそれ以外の焼酎では、64成分に有意差があった。ステップワイズ法で8成分(ノナナール、イソブチルアルコール、α-テルピネオール、吉草酸エチル、カプリル酸エチル、安息香酸、グアヤコール及び2,5-ジメチルピラジン)の変数を選択し、判別分析を行い、181試料中171が適切に判別された。判別精度を検討したところ、93.9%であった。米焼酎と麦焼酎では、ステップワイズ法で8成分(ベンズアルデヒド、イソアミルアルコール、ゲラニオール、2-メチル酪酸エチル、吉草酸エチル、及び2-ペンチルフラン)の変数を選択し、81試料中80が適切に判別された。判別精度を検討したところ、96.3%であった。更に、米焼酎及び麦焼酎の揮発性成分間の相関解析を行い、高い相関性を示す成分について考察を加えた。

Eighty-four volatile compounds of shochu were analyzed by head space solid phase micro extraction(SPME) and direct head space analysis. There was a significant difference in 64 volatile compounds between the groups of rice shochu and barley shochu as well as other shochu. In a stepwise discriminant analysis procedure using nonanal,isobutyl alcohol, α-terpineol, ethyl valerate, ethyl caprylate, ethyl benzoate, guaiacol, and 2,5-dimethylpyrazine, 171 of 181 samples were rightly classified. Estimating the accuracy of the discriminant analysis by cross validation, the ratios of appropriate classification were 93.9%. In rice shochu and barley shochu, in a stepwise discriminant analysis procedure using benzaldehyde, isoamyl alcohol, geraniol, ethyl 2-methylbutyrate, ethyl valerate and 2-pentylfuran, 80 of 81 samples were rightly classified. On estimating the accuracy of the discriminant analysis by cross validation, the ratios of appropriate classification were 96.3%. In addition, the correlation between the compounds in rice shochu and barley shochu were analyzed. The compounds showing a high correlation were given consideration

掲載雑誌
日本醸造協会誌, 111 (12), 841-873 (2016)

9 Genome sequence of Aspergillus luchuensis NBRC 4314 Aspergillus luchuensis NBRC 4314株のゲノムシークエンス

著者
Osamu Yamada, Masayuki Machida, Akira Hosoyama, Masatoshi Goto, Toru Takahashi, Taiki Futagami, Youhei Yamagata, Michio Takeuchi, Tetsuo Kobayashi, Hideaki Koike, Keietsu Abe, Kiyoshi Asai, Masanori Arita, Nobuyuki Fujita, Kazuro Fukuda, Ken-ichi Higa, Hiroshi Horikawa, Takeaki Ishikawa, Koji Jinno, Yumiko Kato, Kohtaro Kirimura, Osamu Mizutani, Kaoru Nakasone, Motoaki Sano, Yohei Shiraishi, Masatoshi Tsukahara, and Katsuya Gomi
山田修、町田雅之、細山哲、後藤正利、高橋徹、二神泰基、山形洋平、竹内道雄、小林哲夫、小池英明、阿部敬悦、浅井潔、有田正規、藤田信之、福田和郎、比嘉賢一、堀川博司、石川雄章、神野浩二、加藤裕美子、桐村光太郎、水谷治、仲宗根薫、佐野元昭、白石洋平、塚原正俊、五味勝也
要約

Awamori is a traditional distilled beverage made from steamed Thai-Indica rice in Okinawa, Japan. For brewing the liquor, two microbes, local kuro (black) koji mold Aspergillus luchuensis and awamori yeast Saccharomyces cerevisiae are involved. In contrast, that yeasts are used for ethanol fermentation throughout the world, a characteristic of Japanese fermentation industries is the use of Aspergillus molds as a source of enzymes for the maceration and saccharification of raw materials. Here we report the draft genome of a kuro (black) koji mold, A. luchuensis NBRC 4314 (RIB 2604). The total length of nonredundant sequences was nearly 34.7Mb, comprising approximately 2,300 contigs with 16 telomere-like sequences. In total, 11,691 genes were predicted to encode proteins. Most of the housekeeping genes, such as transcription factors and N-and O-glycosylation system, were conserved with respect to Aspergillus niger and Aspergillus oryzae. An alternative oxidase and acid-stable α-amylase regarding citric acid production and fermentation at a low pH as well as a unique glutamic peptidase were also found in the genome. Furthermore, key biosynthetic gene clusters of ochratoxin A and fumonisin B were absent when compared with A. niger genome, showing the safety of A. luchuensis for food and beverage production. This genome information will facilitate not only comparative genomics with industrial kuro-koji molds, but also molecular breeding of the molds in improvements of awamori fermentation.

泡盛は沖縄の伝統的蒸留酒であり、その製造には、黒麴菌と泡盛酵母とが利用されている。酵母は世界中でアルコール醗酵に関わるのに対して、Aspergillus属糸状菌に原材料を糖化させるのが日本の醸造産業の特色である。ここに黒麴菌Aspergillus luchuensis BRC 4314 (RIB 2604)のドラフトゲノム配列を報告する。そのサイズは34.7Mb、16のテロメア配列を含む2,300のコンティグからなり、転写因子やN-及びO-グリコシル酵素などの基本的な遺伝子は保存されていた。また、alternative oxidaseや耐酸性α-アミラーゼなどのクエン酸生産関連遺伝子の他、ユニークなglutamic peptidaseも見出された。さらにochratoxin Aやfumonisin B生合成に関与する遺伝子は見当たらず、黒麴菌の醸造における安全性が示唆された。このゲノム情報は、黒麴菌や泡盛醸造研究を促進するだろう。

掲載雑誌
DNA Research, 23, 507-515 (2016)

2017/1/17 掲載

2. 第2四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 平成26酒造年度全国新酒鑑評会出品酒の分析について Analysis of Sake Components Presented to Sake Contest in 2015

著者
藤井力、磯谷敦子、飯塚幸子、伊豆英恵、神田涼子、家村芳次
Tsutomu FUJII, Atsuko ISOGAI, Sachiko IIZUKA, Hanae IZU, Ryoko KANDA,and Yoshitsugu IEMURA
要約

平成26酒造年度全国新酒鑑評会(第103回鑑評会)は、当該年度生産清酒を全国的に調査研究することにより、製造技術と酒質の現状及び動向を明らかにし、もって清酒の品質及び酒造技術の向上に資するとともに、国民の清酒に対する認識を高めることを目的として、日本酒造組合中央会との共催により実施した。

審査は、酒類総合研究所広島事務所において、平成27年4月21日(火)から23日(木)の3日間に予審を行い、5月12日(火)及び13日(水)に決審を行った。また、5月27日(水)に東広島運動公園体育館で製造技術研究会を開催するとともに、6月20日(土)に日本酒造組合中央会主催の東京池袋のサンシャインシティ・文化会館展示ホールでの公開きき酒会を後援した。

出品は852点であった。審査の結果、優秀と認められた415点を入賞酒とし、さらに、決審において特に優秀と認められた222点に金賞を授与した。また、出品酒を公開する製造技術研究会及び公開きき酒会には、全国からそれぞれ、1,449人及び3,214人が来場した。

出品酒については、審査に加え酒質の現状及び動向を調査研究するため、出品者の記載による「全国新酒鑑評会出品酒調査表」(以下、「調査表」という。)の内容を集計するとともに、成分分析(平成25酒造年度から開始した「カビ臭」と「老ねやすさ」の受託分析を含む。)を行った。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告, 188, 1-16 (2016)

2 第38回本格焼酎鑑評会について Review of the 38th Honkaku Shochu Contest in 2015

著者
山田修、向井伸彦、水谷治、西堀奈穂子、小野 玄記、赤尾健、清水 秀明、神本真紀、家村芳次
Osamu YAMADA, Nobuhiko MUKAI, Osamu MIZUTANI, Nahoko NISHIBORI, Genki ONO, Takeshi AKAO, Hideaki SHIMIZU, Maki KAMIMOTO, and Yoshitsugu IEMURA
要約

単式蒸留しょうちゅうの品質を全国的に調査研究することにより、製造技術と酒質の現状及び動向を把握するとともに製造業者の参考とするため、第38回本格焼酎鑑評会を日本酒造組合中央会と共催で開催した。出品資格は、単式蒸留しょうちゅうの製造免許を受けている製造者で、かつ日本酒造組合中央会の組合員に限った。官能審査は平成27年6月 1日(月)及び6月2日(火)に行い、単式蒸留しょうちゅうの製造に関与している者等が出品酒をきき酒する製造技術研究会は6月26日(金)に当所で開催し103名が参加した。なお、昨年度から輸出促進等に資する品質確保のために、分析を希望する出品者に対して有料でメタノールの受託分析を実施している。出品酒の官能審査及び成分分析結果の概要について報告する。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告, 188, 17-27 (2016)

3 平成26年度全国地ビール醸造者協議会醸造技術研修会出品酒の分析について Analysis of Beer Components Presented to the Annual workshop of Japan Brewers Association in 2014

著者
日下一尊、高橋正之、矢澤彌、水野昭博
Kazutaka KUSAKA, Masayuki TAKAHASHI, Hisashi YAZAWA, and Akihiro MIZUNO
要約

平成26年度全国地ビール醸造者協議会醸造技術研修会(以下、「研修会」という。)は、地ビールの品質及び醸造技術向上を目的として、全国地ビール醸造者協議会(Japan Brewers Association、以下、「JBA」という。)の主催により、平成26年11月5日(水)から7日(金)の3日間、酒類総合研究所広島事務所(以下、「酒総研」という。)において25社42名が参加して実施された。研修会では、ビール醸造に関する講義・実習に加え、参加者から事前に出品された自社製品(以下、「出品酒」という。)について、品質の把握及び参加者の官能評価能力の向上を目的として官能評価が行われた。25社、28製造場から、47点の出品があった。官能評価の集計結果は、研修会の最終日に参加者に公表された。事前に酒総研において実施した出品酒の成分分析及び微生物検査について、結果をまとめた。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告, 188, 28-32 (2016)

4 平成27年度全国地ビール醸造者協議会醸造技術研修会出品酒の分析について Analysis of Beer Components Presented to the Annual workshop of Japan Brewers Association in 2015

著者
髙橋正之、日下一尊、矢澤彌、水野昭博
Masayuki TAKAHASHI, Kazutaka KUSAKA, Hisashi YAZAWA, and Akihiro MIZUNO
要約

平成27年度全国地ビール醸造者協議会醸造技術研修会(以下「研修会」という。)は、地ビールの品質及び醸造技術向上を目的として、全国地ビール醸造者協議会(Japan Brewers Association、以下、「JBA」という。)の主催により、平成27年11月10日(火)から12日(木)の3日間、酒類総合研究所広島事務所(以下「酒総研」という。)において16社29名が参加して実施された。研修会では、ビール醸造に関する講義・実習に加え、参加者から事前に出品された自社製品(以下、「出品酒」という。)について、品質の把握及び参加者の官能評価能力の向上を目的として官能評価が行われた。17社、21製造場から、35点の出品があった。官能評価の集計結果は、研修会の最終日に参加者に公表された。事前に酒総研において実施した出品酒の成分分析及び微生物検査について、結果をまとめた。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告, 188, 33-37 (2016)

5 全国新酒鑑評会出品酒の「香辛料様・4VG」の特性に関与する香気成分 Aroma Compounds responsible for the "spicy/4VG" character of sake submitted to Sake Contests

著者
磯谷敦子、神田涼子、飯塚幸子、藤井力
Atsuko ISOGAI, Ryoko KANDA, Sachiko IIZUKA, Tsutomu FUJII
要約

全国新酒鑑評会において、出品酒の5~10%程度に「香辛料様・4VG」の特性が感知されるものがある。「香辛料様・4VG」の特性に寄与する成分として4-vinylguaiacol(4VG)が知られているが、それ以外の成分は不明である。筆者らは、2013年および2014年開催の全国新酒鑑評会出品酒を用いて「香辛料様・4VG」の特性に寄与する成分を検討した。揮発成分の網羅解析の結果、「香辛料様・4VG」指摘酒は指摘のない対照に比べてguaiacol、4VG、ラクトン類、エチルエステル類濃度が高い傾向がみられた。このうちguaiacolおよび4VGは、GC-olfactometryにおいて「薬品・煙様」、「カレー・香辛料様」のにおいとして検出され、「香辛料様・4VG」の特性への関与が推察された。SBSE-GC-MSによりフェノール化合物の定量分析を行ったところ、guaiacol濃度は「香辛料様・4VG」の指摘数が多いものほど高くなる傾向がみられ、清酒の閾値(22 μg/L)を超えるものもあった。4VGについては加熱脱着時のフェルラ酸の分解を受けるため分析値はやや高い値となるが、それを差し引いても指摘酒では少なくとも70%のものが検知閾値(52 μg/L)以上の濃度であると推定された。4EGは数点の試料からしか検出されなかったが、指摘酒のうち1点に比較的高濃度の4EGが含まれていた。これらの結果から、鑑評会出品酒の「香辛料様・4VG」の特性には4VGだけでなくguaiacolや4EGも関与していると考えられた。

"Spicy/4VG" character is perceived in 5-10% of sake submitted to Sake Contests. However, the aroma compounds responsible for the character are not known except for 4-vinylguaiacol (4VG). We investigated the aroma compounds responsible for the "spicy/4VG" character in sake submitted to Sake Contests in 2013 and 2014. Comprehensive volatile compound analysis revealed that sake with a "spicy/4VG" character contained higher levels of guaiacol, 4VG, lactones, and ethyl esters compared with controls, sake without the character. Among those compounds, guaiacol and 4VG were detected as having "medicine/smoke" and "curry/spicy" odors reminiscent of a "spicy/4VG" character by GC-olfactometry. We then analyzed volatile phenol compounds using SBSE-GC-MS. The concentration of guaiacol tended to increase as the number of panelists indicating a "spicy/4VG" character, and it exceeded its detection threshold (22 μg/L) in several sake samples. Although the concentration of 4VG was affected by the degradation of ferulic acid during thermal desorption process, its concentration was estimated to exceed its detection threshold (52 μg/L) in at least 70% of sake with a "spicy/4VG" character. 4-Ethylguaiacol (4EG) was detected only in a few samples, but one sample with "spicy/4VG" character contained a relatively high level of 4EG. These results indicated that not only 4VG but guaiacol and 4EG contributed to the "spicy/4VG" character of sake.

掲載雑誌
日本醸造協会誌,111 (7), 483-492 (2016)

6 カプロン酸エチル高生成焼酎酵母の育種および実用化に関する研究(第1報)カプロン酸エチル高生成焼酎酵母の育種 The breeding of high ethyl caproate shochu yeast and its practical application (Part 1) Breeding of high ethyl caproate shochu yeast

著者
武藤貴史、稲橋正明、万膳博幸、木崎康造、岡崎直人、石川雄章、佐藤和夫、赤尾健
Takafumi Muto, Masaaki Inahashi, Hiroyuki Manzen, Yasuzo Kizaki, Naoto Okazaki, Takeaki Ishikawa, Kazuo Sato and TakeshiAkao
要約

焼酎は我が国の伝統的な蒸留酒である。本研究では、間の細胞-胞子接合法を用いて、清酒酵母K1601ときょうかい焼酎2号(S2)より、セルレニンに耐性を有するカプロン酸エチルを高生成する焼酎酵母NS2-16株を育種した。NS2-16株は、DNA含量から三倍体と推定された。NS2-16の親株のひとつであるS2よりも発酵力が高かった。また、NS2-16のカプロン酸エチル生成能は、継代30世代以上でも安定的に維持されることを確認した。NS2-16は、高温(38℃)及び低pH(3.2)の環境下でも生育可能であることから、焼酎製造に適していると考えられた。

Shochu is a traditional Japanese distilled liquor. In this study, cerulenin resistant and ethyl caproate high producing shochu yeast NS2-16 was bred by cell-sore mating method of K1601 and Kyokai shochu yeast No. 2 (S2). NS2-16 was estimated to be triploid by its DNA content. The fermentation power of NS2-16 was stronger than that of one of parent strain S2. The stable properties of NS2-16, for example ethyl caproate productivity, were confirmed to be maintained throughout more than 30 generations. Because NS2-16 was able to grow well at higher temperature (38℃) and in a lower pH (3.2)environment, it was confirmed to be a yeast suitable for shochu production.

掲載雑誌
日本醸造協会誌, 111 (8), 556-562 (2016)

7 甘藷焼酎の揮発性成分組成の特性と簡易判別及びその利用 Characteristics of the volatile composition and simplified discrimination of sweet potato shochu and its application

著者
福田央・韓錦順・水谷治、金井宗良、山田修
Hisashi FUKUDA, Jinshun HAN, Osamu MIZUTANI, Muneyoshi KANAI and Osamu YAMADA
要約

甘藷焼酎の低沸点香気成分及び中高沸点香気成分84成分を分析・比較し、甘藷の特徴となる成分を把握し、甘藷焼酎の判別を試みた。その結果、甘藷焼酎とそれ以外の焼酎では40分に有意差があり、ステップワイズ法で4成分(ファルネソール、α-テルピネオール、ネロール及びグアヤコール)の変数を選択し、判別分析を行った。また、判別分析の精度を検討したところ、97.8%の精度であった。更に、ファルネソール及びグアヤコールによる甘藷焼酎とそれ以外の焼酎の判別分析を行い、重心ではなく近似式からの距離により判別したところ、良好な判別が可能となった。更に、同様の方法を黒糖焼酎及び泡盛でも検討した。

To classify the compounds of sweet potato shochu, we analyzed 78 volatile compounds by head space solid phase micro extraction(SPME), and 6 volatile compounds by direct head space analysis. The results revealed a significant difference in 40 volatile compounds between sweet potato shochu and other shochu. In a stepwise discriminant analysis procedure, 177 of 181 samples were rightly classified by 4 volatile compounds (farnesol, α-terpineol, nerol, and guaiacol). Estimating the accuracy of the discriminant analysis by cross validation, the ratios of appropriate classification were 97.8%. In discrimination analysis of sweet potato shochu and the other shochu on the basis ofα-terpineol and guaiacol, the standard of judgment based on distance calculated from an approximate formula without centroides provides satisfactorily discrimination. In addition, application of a similar method was examined in Kokuto Shochu and Awamori.

掲載雑誌
日本醸造協会誌, 111 (8), 545-555 (2016)

8 ワイン酵母・清酒酵母による焼酎醸造試験及び揮発性成分の比較 Shochu Brewing Tests using Wine and Sake yeasts and comparison of the volatile compounds

著者
福田央、周延、韓錦順
Hisashi FUKUDA, Yan ZHOU and Jinshun HAN
要約

ワイン酵母及び清酒酵母を用いて焼酎小仕込試験を行い、発酵力と揮発性成分組成を検討した。供試菌株の内、14株は発酵力が弱かった。揮発性成分の相関性を検討したところ、19の成分対に絶対値0.6以上の相関性が認められた。揮発性成分の特徴から18株を選択し、その特徴を確認するため、再度、焼酎小仕込試験を行ったところ、揮発性成分組成の傾向は、各々の株においてほぼ変わっていなかった。これらの結果から、選択された18株は、揮発性成分の特徴を有する焼酎製造に有用であることが確認された。

In the small-scale rice-shochu making tests, wine yeast and sake yeast were studied the ability of fermentation and the volatile composition.14 strains of tested yeast train were showed low fermentation ability. A correlation between volatile compounds was evaluated, the correlation coefficients of 19 data pairs is more than absolute value >0.6. 18 strains were selected on the basis of the volatile composition characteristics. To confirm the the volatile composition of schochu brewed by these strains, they were re-tested to make rice shochu in the small scale. In the each yeast strain, the overall tendency of the volatile composition was not change. From these results, 18 strains selected were useful making shochu in volatile composition characteristics.

掲載雑誌
日本醸造協会誌, 111 (9), 611-624 (2016)

9 Identification of a mutation causing a defective spindle assembly checkpoint in high ethyl caproate-producing sake yeast strain K1801. カプロン酸エチル高生産清酒酵母K1801におけるスピンドルアセンブリーチェックポイント欠損を引き起こす原因変異の同定

著者
Tetsuya GOSHIMA, Ryo NAKAMURA, Kazunori KUME, Hiroki OKADA, Eri ICHIKAWA, Hiroyasu TAMURA, Hirokazu HASUDA, Masaaki INAHASHI, Naoto OKAZAKI, Takeshi AKAO, Hitoshi SHIMOI, Masaki MIZUNUMA, Yoshikazu OHYA, Dai HIRATA
五島徹也、中村諒、久米一規、岡田啓希、市川絵梨、田村博康、蓮田寛和、稲橋正明、岡崎直人、赤尾健、下飯仁、水沼正樹、大矢禎一、平田大
要約

In high-quality sake brewing, the cerulenin-resistant sake yeast K1801 with high ethyl caproate-producing ability has been used widely; however, K1801 has a defective spindle assembly checkpoint (SAC). To identify the mutation causing this defect, we first searched for sake yeasts with a SAC-defect like K1801 and found that K13 had such a defect. Then, we searched for a common SNP in only K1801 and K13 by examining 15 checkpoint-related genes in 23 sake yeasts, and found 1 mutation, R48P of Cdc55, the PP2A regulatory B subunit that is important for the SAC. Furthermore, we confirmed that the Cdc55-R48P mutation was responsible for the SAC-defect in K1801 by molecular genetic analyses. Morphological analysis indicated that this mutation caused a high cell morphological variation. But this mutation did not affect the excellent brewing properties of K1801. Thus, this mutation is a target for breeding of a new risk-free K1801 with normal checkpoint integrity.

高品質な清酒醸造においては、高カプロン酸エチル生産性を有するセルレニン耐性清酒酵母K1801が広く使用されている。しかし、K1801はスピンドルアセンブリーチェックポイント(SAC)機能に欠陥がある。この機能欠損を引き起こす原因変異を同定するために、我々は最初にK1801同様にSAC欠陥を示す清酒酵母の探索を行い、K13が、このような欠陥を持つことを発見した。その後、我々は清酒酵母23株における、15個のチェックポイント関連遺伝子配列を調べることによって、K1801およびK13における共通のSNPを探索し、SACに重要なPP2A調節BサブユニットであるCdc55に1つの突然変異R48Pを見出した。さらに、分子遺伝学的解析により我々はCdc55-R48P変異がK1801におけるSAC-欠陥の原因であることを確認した。形態学的分析によっても、この変異が高い細胞形態学的変化を引き起こすことが示された。しかし、この変異によっては、K1801の優れた醸造特性に影響を及ぼさない。したがって、この変異は、通常のチェックポイント機能を持つリスクフリーなK1801の育種のターゲットとなる。

掲載雑誌
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 80 (8), 1657-1662 (2016)

10 Substantial decrease in cell wall α-1,3-glucan caused by disruption of the kexB gene encoding a subtilisin-like processing protease in Aspergillus oryzae. 麴菌におけるスブチリシン様プロセシングプロテアーゼ kexB 遺伝子破壊は細胞壁α-1,3-グルカンの劇的な減少を引き起こす

著者
Osamu Mizutani, Matsuko Shiina, Akira Yoshimi, Motoaki Sano, Takeshi Watanabe, Youhei Yamagata, Tasuku Nakajima, Katsuya Gomi, Keietsu Abe
水谷治、椎名松子、吉見啓、佐野元昭、渡邉剛志、山形洋平、中島佑、五味勝也、阿部啓悦
要約

Disruption of the kexB encoding a subtilisin-like processing protease in Aspergillus oryzae (ΔkexB) leads to substantial morphological defects when the cells are grown on Czapek-Dox agar plates. We previously found that the disruption of C causes a constitutive activation of the cell wall integrity pathway. To understand how the disruption of the kexB affects cell wall organization and components, we analyzed the cell wall of ΔkexB grown on the plates. The results revealed that both total N-acetylglucosamine content, which constitutes chitin, and chitin synthase activities were increased. Whereas total glucose content, which constitutesβ-1,3-glucan and α-1,3-glucan, was decreased; this decrease was attributed to a remarkable decrease in α-1,3-glucan. Additionally, the β-1,3-glucan in the alkali-insoluble fraction of the ΔkexB showed a high degree of polymerization. These results suggested that the loss of α-1,3-glucan in the ΔkexB was compensated by increases in the chitin content and the average degree of β-1,3-glucan polymerization.

麴菌のスブチリシン様プロセシングプロテアーゼ kexB 遺伝子破壊株 (ΔkexB) は、Czapek-Dox プレート(最少培地)上での生育時に相当な形態的欠失を引き起こします。我々は、以前の研究で kexB の破壊は、細胞壁統合性シグナル伝達経路の恒常的な活性化を引き起こすことを示してきました。そこで、本論文では kexB 破壊がどのように細胞壁の組成や構成成分に影響をもたらすのかを理解するために、プレート上で生育させたΔkexB 株の細胞壁を解析した。その結果、キチン含量を示す N-アセチルグルコサミンとキチン合成酵素活性が増加していることを明らかにした。一方、β-1,3-グルカンやα-1,3-グルカン含量を示すグルコースは減少し、この減少は細胞壁α-1,3-グルカンの顕著な減少に起因した。加えて、ΔkexB 株のアルカリ不溶画分に含まれるβ-1,3-グルカンは、野生株のそれと比較して、高い重合度を示した。これらの結果は、ΔkexB 株のα-1,3-グルカンの減少が、キチン含量とβ-1,3-グルカンの重合度の増加によって補償されていることが示唆された。

掲載雑誌
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 80 (9), 1781-1791 (2016)

11 Development of promoter shutoff system in Aspergillus oryzae using sorbitol-sensitive promoter. 麹菌のソルビトール応答性プロモーターによるプロモーターシャットオフシステムの開発

著者
Ken Oda, Shiho Terado, Rieko Toyoura, Hisashi Fukuda, Moriyuki Kawauchi, Kazuhiro Iwashita
織田健、寺戸志保、豊浦利枝子、福田央、河内護之、岩下和裕
要約

Promoter shutoff is a general method for analyzing essential genes, but there are no tightly repressed promoters reported in A. oryzae. To overcome the current limitations of conditional promoters, we examined the sorbitol and galactose responsive genes by microarray to identify regulatable genes with only minor physiological and genetic effect. We identified 2 sorbitol-induced genes (designated as sorA and sorB,) and cloned their promoters, and built a regulated EGFP and BrlA expression system. Growth medium-dependent EGFP fluorescence and conidiation were confirmed for egfp and brlA under the control of these promoters, respectively. This shutoff system was also applied to essential rhoA regulation, which showed the expected growth inhibition under the repressed growth condition. The new sorbitol promoter shutoff system reported here can serve as a valuable new tool for essential gene analysis in filamentous fungi.

プロモーターシャットオフは、致死性遺伝子の解析において一般的であるが、麹菌では有用な制御が厳密なプロモーターが存在しない。麹菌での制御プロモーターを開発するため、ソルビトール応答性の遺伝子をマイクロアレイ解析により探索した。2つの遺伝子sorA, sorBを同定し、そのプロモーターによるEGFPおよびBrlA発現系を構築し、制御能を検証したところ、C源依存性のEGFPの発現およびBrlAによる分生子形成が観察された。さらに、致死性遺伝子であるrhoAの解析に適応したところ、完全にコントロールされた。よって、開発されたソルビトール応答性プロモーターシャットオフシステムは、糸状菌の致死遺伝子の機能解析の為のツールとして利用できる。

掲載雑誌
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 80 (9), 1792-1801 (2016)

12 Spatial control of translation repression and polarized growth by conserved NDR kinase Orb6 and RNA-binding protein Sts5. 進化上保存されたNDRキナーゼOrb6およびRNA結合タンパク質Sts5による翻訳抑制や極性成長の空間的制御

著者
Illyce NUNEZ, Marbelys Rodriguez PINO, David J WILEY, Maitreyi E DAS, Chuan CHEN, Tetsuya GOSHIMA, Kazunori KUME, Dai HIRATA, Takashi TODA, Fulvia VERDE
Illyce Nunez、Marbelys Rodriguez Pino、David J Wiley、Maitreyi E Das、Chuan Chen、五島徹也、久米一規、平田大、登田隆、Fulvia Verde
要約

RNA-binding proteins contribute to the formation of ribonucleoprotein (RNP) granules by phase transition, but regulatory mechanisms are not fully understood. Conserved fission yeast NDR (Nuclear Dbf2-Related) kinase Orb6 governs cell morphogenesis in part by spatially controlling Cdc42 GTPase. Here we describe a novel, independent function for Orb6 kinase in negatively regulating the recruitment of RNA-binding protein Sts5 into RNPs to promote polarized cell growth. We find that Orb6 kinase inhibits Sts5 recruitment into granules, its association with processing (P) bodies, and degradation of Sts5-bound mRNAs by promoting Sts5 interaction with 14-3-3 protein Rad24. Many Sts5-bound mRNAs encode essential factors for polarized cell growth, and Orb6 kinase spatially and temporally controls the extent of Sts5 granule formation. Disruption of this control system affects cell morphology and alters the pattern of polarized cell growth, revealing a role for Orb6 kinase in the spatial control of translational repression that enables normal cell morphogenesis.

RNA結合タンパク質はリボヌクレオタンパク質(RNP)顆粒の形成に関係するが、制御機構については完全にはわかっていない。進化上保存された分裂酵母NDR (Nuclear Dbf2-Related)キナーゼOrb6は、Cdc42 GTPaseを空間的にコントロールすることで細胞形態形成を制御している。この論文において、我々はOrb6キナーゼ独自の機能として、RNA結合タンパク質Sts5のRNPへのリクルートを負に制御し、極性細胞成長を促進させているという、新知見を報告する。我々は、Orb6キナーゼがSts5のPボディ関連グラニュールへのリクルートと、Sts5と14-3-3タンパク質Rad24の相互作用よりに引き起こされるSts5結合mRNAの分解を阻害していることを発見した。Sts5結合mRNAの大多数は極性細胞成長に必須な因子をコードしており、Orb6キナーゼは時空間的にSts5グラニュール形成の範囲を制御している。これらの制御機構の破壊は細胞形態に影響を与え、極性細胞成長パターンを変化させる。したがって、正常な細胞形態形成を可能にする翻訳抑制の空間的な制御におけるOrb6キナーゼの役割が明らかとなった。

掲載雑誌
eLIFE, 5, e14216 (2016)

2016/12/27 掲載

1. 第1四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 市販泡盛の揮発性成分組成の特性 Characteristics of the volatile composition of commercially available Awamori

著者
福田央、韓錦順、山田修
Hisashi FUKUDA, Jinshun HAN and Osamu YAMADA
要約

市販泡盛の低沸点香気成分及び中高沸点香気成分84成分を分析・比較し、泡盛の特徴となる成分を把握し、古酒と一般酒の判別、及び泡盛とそれ以外の焼酎の判別を試みた。その結果、古酒と一般酒では42成分に有意差があり、ステップワイズ法で7成分の変数を選択し、判別分析を試みた。また、判別分析の検証を行ったところ、92.6%の精度であった。泡盛とそれ以外の焼酎では、84成分中59成分に有意差があり、ステップワイズ法で6成分の変数を選択し、判別分析を試みた。また、判別分析の検証を行ったところ、98.1%の精度であった。更に、貯蔵年数の違いによる成分についても検討した。

To classify their compounds of commercially available Awamori, we analyzed 78 volatile compounds by head space solid phase micro extraction (SPME), and 6 volatile compounds by direct head space analysis. There was a significant difference in 42 volatile compounds between aged Awamori and Ippanshu. In a stepwise discriminant analysis procedure, 91 of 95 samples were rightly classified by 7 volatile compounds (diacetyl, ethyl isovalerate, isoamyl acetate, propyl caprate, ethyl crotonate, vanillin, and DMTS). Estimating the accuracy of the discriminant analysis by cross validation, the ratios of appropriate classification were 92.6%. For Awamori and the other Shochu, there was a significant difference in 59 of 84 volatile compounds. A total of 256 of 260 samples were rightly classified by 6 volatile compounds (isobutyl alcohol,1-octen-3-ol, nerolidol, 2-methylbutyl acetate, methyl salicylate, and ethyl S-methyl thioacetate). When estimating the accuracy of the discriminant analysis, the ratios of appropriate classification were 98.1%. In addition, volatile compounds changing due to aging were investigated.

掲載雑誌
日本醸造協会誌 Vol.111, No.4, p.261-270 (2016)

2016/7/7 掲載