令和5年度 研究成果

SHIMIZU Hideaki, KAMADA Aya, KOYAMA Kazuya, IWASHITA Kazuhiro, and GOTO-YAMAMOTO Nami

Making wine via spontaneous fermentation without sulfur dioxide and commercial yeast (spontaneous winemaking) is increasing in recent year, but there is scant research regarding microbial communities present in Japan during spontaneous winemaking using culture-independent molecular methods. We analyzed fungal communities and populations during laboratory-scale spontaneous winemaking using sterilized labware to avoid winery-resident microbes. In the spontaneous fermentation of four grape varieties (Pinot Noir, Riesling, Koshu, and Koshusanjaku) grown in the same Japanese vineyard, our analysis of yeast and other fungal species by next-generation sequencing based on the ITS1 region demonstrated that S. cerevisiae was eventually dominant in seven of 12 fermentation batches (three replications for each grape variety), whereas non-Saccharomyces species (e.g., Schizosaccharomyces japonicus, Lachancea dasiensis,and Hanseniaspora valbyensis) became dominant in four batches at the end of fermentation. In another batch, lactic acid bacteria (LAB) became dominant and the fermentation remained incomplete. Diverse microbes were involved in the spontaneous fermentation (particularly in Koshusanjaku), indicating that residual sugar remained and lactic and acetic acid largely increased. Compared to the control wine made with SO₂ and commercial yeast, the concentration of lactic acid was 45-fold higher in the must dominated by L. dasiensis,and the concentrations of acetic acid and lactic acid were 10-fold and 19-fold higher in the must dominated by LAB, respectively. Even when indigenous S. cerevisiae became dominant, the finished wines obtained high sensory-analysis scores for 'complexity' but low scores for 'varietal typicality', indicating the risk of fermentation with unselected wild yeast on the grapes grown in Japan.

髙橋圭、奥田将生、上用みどり、沼田美子代、包紅彬、河野弘美

酒造用原料米の醸造特性と出穂後１ヶ月間の気温条件との相関関係の詳細は明らかではなかった。本研究では、我々は2002年から2019年の酒米０次分析で得られた22米品種の醸造特性と地域気象観測システム（アメダス）から得られたイネ出穂後気温データとの関係を詳細に解析した。玄米千粒重は、出穂後１ヶ月間の最低気温、最高気温のいずれとも負の相関を示した。一般米では最低気温との相関が強く、酒造好適米では平均気温、最高気温との相関が強い傾向が示唆された。米品種によるものの、出穂後１ヶ月間の中期から後期の気温の影響がより大きい傾向が認められた。吸水率は、20分吸水率、120分吸水率共に、特に出穂後１ヶ月間の最高気温と正の相関を示した。粗タンパク質含量は、出穂後１ヶ月間の最低気温や平均気温と正の相関を示し、特に最低気温と相関を示す品種が多かったことから、夜間の気温の影響を強く受け、夜間の気温が高いと粗タンパク質含量が高くなることが示唆された。FNは、粗タンパク質含量及びBrix値双方の影響を受け、出穂後１ヶ月間の気温条件の影響が相殺されたと考えられ、一定の傾向を示さなかった。Brix/FN比は、出穂後１ヶ月間の最低気温、最高気温のいずれとも負の相関を示した。以上から、酒造用原料米の醸造特性と出穂後１ヶ月間の気温条件との相関関係を明らかにした。 　　　 　 　　

藤田晃子、赤松史一、山田修

全国新酒鑑評会の出品酒におけるグルコース濃度と予審の「総合評価」の関係を調べるため、3年分の出品吟醸酒2567点の成分値と官能評価結果を用いて統計解析を行った。その結果、出品酒のグルコース濃度と官能評価時における酒間のグルコース濃度の差は、「総合評価」への有意な影響が認められなかった。必須評価項目の「華やか」及び「あと味・軽快さ」が良好な出品酒は、「総合評価」も良好であった。一方で、任意指摘項目の欠点臭である「硫化物様」や「カビ臭」等の指摘が、「総合評価」を大きく悪化させていた。本研究結果は、全国新酒鑑評会の予審において、審査委員が、香味の調和と特徴を評価対象とする審査基準に則り、特定の成分に左右されず各々の出品酒に真摯に向き合って独立した官能評価を与えていたことを支持するものである。同時に、清酒醸造の基本である欠点臭を生じさせない製造の品質管理と香味の調和をとる製造技術が、良好な結果に必要不可欠であることが示された。 　　　 　 　　

長船行雄、利田賢次、韓錦順、磯谷敦子、向井伸彦

官能評価体系を確立する上で、標準的な香り見本と官能評価用語の整理を実施することは重要な課題である。これまでに当所においては、香気成分の閾値調査や香気寄与度の検討を行ってきた。その結果、本格焼酎・泡盛の標準見本として32種類の標準見本候補物質が選抜された。本研究では、設定濃度や対応する評価用語の妥当性について検証するために、これらの化合物を用いて本格焼酎・泡盛の専門家による官能評価を実施した。 　　　 　 　　

その結果、一部物質の濃度の増加及び提供方法の変更を行うことで標準見本として活用可能であることが示唆された。併せて、表現が非常に類似した成分については見直しを実施し、最終的には30成分を標準見本として採用することとした。また、本研究で収集した表現用語等を参考に本格焼酎・泡盛フレーバーホイールを作成した。 　　　 　 　　

清水秀明、鎌田綾、小山和哉、岩下和裕、後藤奈美

亜硫酸および酵母無添加のワイン製造において、醸造機器やブドウ畑のSaccharomyces cerevisiaeが発酵に関与するとの報告もあるが、樽の洗浄後にどの程度酵母が残存し発酵に関与するかを調べた報告は少ない。そこで、S. cerevisiaeで発酵させた醪にオークチップを浸漬することで酵母を定着した後、（１）水洗い、（２）80℃熱処理、（３）50 mg/L亜硫酸浸漬、（４）30％エタノール浸漬の４区分の洗浄処理を行った。その後、当該チップに殺菌処理した果汁を加えた結果、（２）80℃熱処理以外の条件で発酵が起こった。さらに、発酵後のオークチップを取り出し水洗いした後、収穫直後の未殺菌の果汁を添加したところ、ブドウ由来のHanseniaspora uvarumとオークチップ由来のS. cerevisiaeが増加し、最終的に約1：1の割合となった。非殺菌果汁発酵終了後のオークチップ表面を走査電子顕微鏡で観察したところ、卵型およびレモン型の酵母が観察され、オークチップのような木材表面は酵母が留まりやすい環境であり、留まった酵母がワインの発酵に関与する可能性を示唆した。 　　　 　 　　

磯谷敦子、池田優理子、日下一尊、向井伸彦、菱沼勇人、上原宏

温度が清酒の品質に及ぼす影響について基盤的な知見を得ることを目的に、市販清酒を0～35℃で最長６か月間貯蔵し、官能評価および成分分析を行った。官能評価の結果、いずれの試料も35℃で老香が顕著に増加し、総合評価が悪くなった。一方、0℃と15℃では、すべての試料において有意差がみられなかった。成分分析の結果、DMTSは35℃で顕著に増加し、25℃以下ではあまり増加がみられなかった。メチオナールは35℃で大きく増加したが、25℃でもやや増加がみられた。DMTS、メチオナールとも老香強度と高い相関を示した。貯蔵開始時と６か月後の各成分の濃度の平均値を比較すると、0℃では変化率は10％以内だったが、25℃ではメチオナールが約2倍に増加し、35℃ではDMTSが10倍以上に増加した。これらの結果から、清酒の品質を保持するためには貯蔵温度は15℃以下が望ましいと考えられた。 　　　 　 　　

AKASE Shiori, TOMONAGA Kazuko, TANAKA Jumpei, MORIYA Chise, KIYOSHI Keiji, AKAO Takeshi, WATANABE Kota, KADOKURA Toshimori, and NAKAYAMA Shunichi

Biotin is an essential coenzyme that is bound to carboxylases and participates in fatty acid synthesis. The fact that sake yeast exhibit biotin prototrophy while almost all other Saccharomyces cerevisiae strains exhibit biotin auxotrophy, implies that biotin prototrophy is an important factor in sake brewing. In this study, we inserted a stop codon into the biotin biosynthetic BIO3 gene (cording for 7,8-diamino-pelargonic acid aminotransferase) of a haploid sake yeast strain using the marker-removable plasmid pAUR135 and investigated the fermentation profile of the resulting bio3 mutant. Ethanol production was not altered when the bio3 mutant was cultured in Yeast Malt (YM) medium containing 10% glucose at 15°C and 30°C. Interestingly, ethanol production was also not changed during the sake brewing process. On the other hand, the levels of organic acids in the bio3 mutant were altered after culturing in YM medium and during sake brewing. In addition, ethyl hexanoate and isoamyl acetate levels decreased in the bio3 mutant during sake brewing. Metabolome analysis revealed that the decreased levels of fatty acids in the bio3 mutant were attributed to the decreased levels of ethyl hexanoate. Further, the transcription level of genes related to the synthesis of ethyl hexanoate and isoamyl acetate were significantly reduced. The findings indicated that although the decrease in biotin biosynthesis did not affect ethanol production, it did affect the synthesis of components such as organic acids and aromatic compounds. Biotin biosynthesis ability is thus a key factor in sake brewing.

MIZUTANI Osamu, KAKIZONO Dararat, TAKAHASHI Toru, MUKAI Nobuhiko, FUKUDA Hisashi, and YAMADA Osamu

To reduce the methanol content in sweet potato shochu, we studied the pectin methylesterase genes of the shochu–koji mold Aspergillus luchuensis. We found the following three homologs of pectin methyleseterase in the genome of A. luchuensis: pmeA, pmeB, and pmeC. Using pectin as a substrate, the methanol-producing activity of the recombinant of each gene expressed in A. luchuensis was examined and found to be present in recombinant PmeA and PmeB. Additionally, small-scale fermentation of sweet potato shochu using disruptions of pmeA and pmeA-pmeB in A. luchuensis (∆pmeA and ∆pmeApmeB) resulted in significant reduction of the methanol content. Taken together, we revealed that the A. luchuensis pmeA gene was mainly involved in methanol production in sweet potato shochu.

山田修、磯谷敦子、藤田晃子、岸本徹、赤松史一、ボルジギンソリナ、西本真樹、神田涼子、寺本聡子、大串憲祐、福田央

令和３酒造年度全国新酒鑑評会（第110回鑑評会）は、当該年度に日本国内で生産された清酒を全国的に調査研究することにより、製造技術と酒質の現状及び動向を明らかにし、もって清酒の品質及び酒造技術の向上に資するとともに、国民の清酒に対する認識を高めることを目的として、日本酒造組合中央会との共催により実施された。

審査は、酒類総合研究所において、令和４年４月20日（水）から22日（金）の３日間に予審を行い、令和４年５月12日（木）から13日（金）の２日間に決審を行った。また、６月１日（水）から２日（木）に東広島運動公園体育館で製造技術研究会を開催するとともに、６月18日（土）に東京国際フォーラムにて開催された日本酒造組合中央会主催の公開きき酒会を共催した。

出品は826点であった。審査の結果、優秀と認められた404点を入賞酒とし、さらに入賞酒の中から決審にて特に優秀と認められた205点に金賞を授与した。また、出品酒を公開する製造技術研究会及び公開きき酒会には、全国からそれぞれ、457人及び772人が来場した。

出品酒については、審査に加え酒質の現状及び動向を調査研究するため、出品者の記載による「全国新酒鑑評会出品酒調査表」の内容を集計するとともに、成分分析（「老ねやすさ」の受託分析を含む。）を行った。

向井伸彦、磯谷敦子、奥田将生、正木和夫、高橋圭、長船行雄、ボルジギン・ソリナ、福田央

単式蒸留焼酎を全国的に調査研究することにより、製造技術と品質の現状及び動向を明らかにし、もって単式蒸留焼酎の製造技術及び品質の向上に資することを目的として、第45回本格焼酎・泡盛鑑評会を酒類総合研究所と日本酒造組合中央会の共催で開催した。

令和４年６月７日（火）及び８日（水）に審査を、６月24日（金）に製造技術研究会を実施した。

出品状況、審査及び化学分析結果の概要について報告する。

日下一尊、岸本徹、神本真紀、寺本聡子

全国地ビール品質審査会2023は、地ビールの醸造技術向上及び品質改善を目的として、全国地ビール醸造者協議会（Japan Brewers Association）の主催により実施しており、本年で７回目となる。今回は37社から107点の出品があり、品質審査会を令和５年３月８日（水）及び９日（木）に、独立行政法人酒類総合研究所（広島県東広島市）（以下、「研究所」という。）で実施した。出品酒については、令和５年２月から４月の期間において、研究所において成分分析及び微生物検査を実施したので、その結果について報告する。

ボルジギン・ソリナ、 磯谷敦子、 向井伸彦

発酵食品や酒類中に微量に含まれるカルバミン酸エチル（以下ECと略す、ウレタンとも呼ばれる）は、動物実験において発がん性を示したことから、国際がん研究機関（IARC）にて、グループ2A（ヒトに対しておそらく発がん性がある）に分類されている。日本においては食品衛生法上の規制値はないが、酒類の安全性を所管する国税庁として、実態の調査等対応している。熟成酒のEC含量については、十分な知見がなく貯蔵期間中のECの増加についても研究が少ない。そこで、本研究で貯蔵期間が0～53年の長期熟成酒91点を対象に、EC含量を調査し、その結果を報告する。

市販長期熟成酒43点のEC含量を調査した結果について、①ECの生成量は貯蔵期間とともに増加した。②低温熟成酒では、平均値が30年まで200 μg/kg以下だった。③常温熟成酒では、ECの生成が促進され、平均値が11～20年で200 μg/kgを超え、最大779 μg/kgだった。④尿素非生産酵母使用の貴醸酒では、同年代の常温熟成酒より遥かに低いＥＣ含量を示した。また、５つの製造場から収集した貯蔵期間（０～15年）の異なる同一銘柄の長期熟成酒については、貯蔵期間中にECの生成が促進され、EC含量が200 μg/kgを超える場合がみられたことから、特に、海外への輸出を前提とした常温長期熟成酒はEC低減策をとる必要がある。尿素非生産酵母の使用により清酒中の尿素の生成を抑える、火入れ前にウレアーゼ処理で清酒中の尿素をアンモニアに分解させる、火入れ後の温度管理（速やかに温度を下げる）を適切に行う、等を考慮する必要があると考えられる。

KOYAMA Kazuya, KONO Atsushi, BAN Yusuke, IWASHITA Kazuhiro, FUKUDA Hisashi, and GOTO-YAMAMOTO Nami

Background and goals
Grapes accumulate proanthocyanidins (PAs), complex polymer mixtures of flavan-3-ol units, in the skin and seeds. The composition of PAs, including subunit ratio and polymer length, and total concentration, is important because of their relationship to sensory properties of grape and wine. It is known that the grape species Vitis vinifera and Vitis labruscana have remarkably different PA concentration and composition. A mapping population derived from a cross between V.labruscana and V.vinifera was used to provide insight into the genetic architecture of PAs, as well as that of PA skin and seed properties.
Methods and key findings
The composition of PA subunits at the terminal and extension positions in the hybrid population’s skin and seeds was examined in great detail. Hierarchical clustering analysis of PA profiles grouped PA variables into five main clusters. There were distinct clusters related to compositional differences in skin and seeds, such as the percentage of galloylated or trihydroxylated subunits, polymer length, and the total PA concentration. A quantitative trait locus (QTL) analysis revealed several different minor loci between skin and seeds, each contributing to the phenotypic variation of total PA concentration. A few major QTLs on linkage groups 1 and 17 were discovered to contribute to the phenotypic variation of PA composition in both skin and seeds.
Conclusions and significance
A distinct genetic architecture between PA composition and total PA concentration in interspecific hybrid grapes was found. In contrast to PA concentration, a similar genetic architecture of PA composition was observed between skin and seeds.

BOERZHIJIN Surina, ISOGAI Atsuko, and MUKAI Nobuhiko

The current study reports the effect of storage length and temperature on the key aroma compounds of aged Japanese sake. In total, 41 bottles of commercial aged sake aged between 3 and 53 years, including 20 bottles of low-temperature (controlled at ≤ 15℃) aged sake and 21 bottles of ambient-temperature aged sake, were analyzed. The concentrations of sotolon, dimethyl trisulfide (DMTS) and 3-methylbutanal were greatly enhanced in ambient-temperature and peaked after 11–20 years of aging. While in low-temperature, the concentration of isoamyl acetate and ethyl caproate, the main compounds that contribute to the freshness of Japanese sake, were maintained above their odor thresholds (0.27 mg/L and 0.12 mg/L, respectively) in 3–30 years aging. Methional concentration decreased along with the aging time in ambient-temperature, while in low-temperature it increased up to 30 years of aging and declined afterwards. The results obtained in this study can be applied as a useful tool to regulate and optimize the aging methods of sake, furthermore, to predict the effects of storage time when applying different temperatures in the sake aging field.

奥田将生、髙橋圭、上用みどり、包紅彬、河野弘美、向井伸彦、木下靖章、榎本安宏、吉岡利晃、岩本理、海老克哉、為久博文

精米条件が酒造用原料米の酒造適性変化に及ぼす影響について調べた。以下の２条件で精米を行った。#90条件：通常より細かい砥石粒度（#90）のロール、低回転数、高電流値、#60条件：砥石粒度、回転数、通常電流値。#60条件では原形から球状に近い形状に精米されたのに対し、#90条件では扁平形状となった。砕米率、胚芽残存率は、#60条件より#90条件の方が高かった。粗タンパク質は#60条件より#90条件の方が低かった。脂質及びナトリウム、マグネシウム、リン、カリウム、カルシウムは、両条件ともに玄米から精米歩合80%時点で大きく減少したが、減少の程度は2つの精米条件により異なり、脂質及びナトリウム、マグネシウム、リン、カリウム、カルシウムは、精米歩合70%まで#60条件より#90条件の方が高かった。吸水率及び水浸裂傷率は、吸水初期において、#60条件より#90条件の方が高かった。消化性のBrix値は#60条件より#90条件の方が若干高く、消化液のアミノ酸含量は#90条件で低く、消化液の無機成分含量は#90条件で高かった。酒造用原料米全国統一分析に基づき精米した精米歩合70%白米の酒造適性値は、精米歩合80~50%の精米歩合の酒造適性値と高い相関がみられた。このことから、精米歩合70%白米の酒造適性分析値でも高度に精米した場合でも酒造適性を評価するには十分利用できることが示唆された。

KLINKAEWBOONWONG Norapat, OHNUKI Shinsuke, CHADANI Tomoya, NISHIDA Ikuhisa, USHIYAMA Yuto, TOMIYAMA Saki, ISOGAI Atsuko, GOSHIMA Tetsuya, GHANEGOLMOHAMMADI Farzan, NISHI Tomoyuki, KITAMOTO Katsuhiko, AKAO Takeshi, HIRATA Dai, and OHYA Yoshikazu

Modification of the genetic background and, in some cases, the introduction of targeted mutations can play a critical role in producing trait characteristics during the breeding of crops, livestock, and microorganisms. However, the question of how similar trait characteristics emerge when the same target mutation is introduced into different genetic backgrounds is unclear. In a previous study, we performed genome editing of AWA1, CAR1, MDE1, and FAS2 on the standard sake yeast strain Kyokai No. 7 to breed a sake yeast with multiple excellent brewing characteristics. By introducing the same targeted mutations into other pedigreed sake yeast strains, such as Kyokai strains No. 6, No. 9, and No. 10, we were able to create sake yeasts with the same excellent brewing characteristics. However, we found that other components of sake made by the genome-edited yeast strains did not change in the exact same way. For example, amino acid and isobutanol contents differed among the strain backgrounds. We also showed that changes in yeast cell morphology induced by the targeted mutations also differed depending on the strain backgrounds. The number of commonly changed morphological parameters was limited. Thus, divergent characteristics were produced by the targeted mutations in pedigreed sake yeast strains, suggesting a breeding strategy to generate a variety of sake yeasts with excellent brewing characteristics.