令和6年度研究成果

2. 第2四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 Carbon stable isotopes of glucose during the degradation of rice by the koji fungus Aspergillus oryzae 麹菌Aspergillus oryzaeによる米の分解過程におけるグルコースの炭素安定同位体について

著者: AKAMATSU Fumikazu, ODA Ken, FUJITA Akiko, IGI Yukari, and ISOGAI Atsuko

赤松史一、織田健、藤田晃子、伊木由香理、磯谷敦子
要旨: Glucose, a key component of traditional Japanese fermented foods, is derived from rice starch via saccharification by hydrolytic enzymes produced by Aspergillus oryzae. The δ¹³C value of glucose reflects that of its rice source. However, the influence of saccharification parameters (glucose concentration, degradation temperature, and reaction time) on glucose δ¹³C values is unclear. Here, we investigated the influence of saccharification on the δ¹³C value of glucose. Our experiments showed a significant difference in the δ¹³C value of glucose (-27.0 ± 0.1 ‰) obtained from saccharification compared to the ingredient rice (-27.1 ± 0.1 ‰) and remaining solid residue (-27.1 ± 0.1 ‰); however, it did not differ significantly from those of rice koji (-27.0 ± 0.1 ‰) and steamed rice (-27.1 ± 0.1 ‰), despite all values being within 0.1 ‰. Notably, glucose concentration, degradation temperature, and reaction time did not significantly affect glucose δ¹³C values. These findings demonstrate the remarkable preservation of glucose δ¹³C values. The δ¹³C values remain aligned with the original δ¹³C value of the rice, even with up to 60 % degradation during A. oryzae saccharification. This persistence of the δ¹³C value throughout the process offers a potential tool for authenticating the origin of rice-fermented beverages based on the δ¹³C value of their glucose component.

日本の伝統発酵食品の主要成分であるグルコースは、Aspergillus oryzaeが作り出す加水分解酵素によって米デンプンを糖化して得られる。グルコースのδ¹³C値は米の値を反映している。しかし、糖化に関する変数（グルコース濃度、分解温度、反応時間）がグルコースのδ ¹³C値にどのように関与しているのか不明である。ここでは、糖化がグルコースのδ¹³C値に及ぼす影響を調べた。その結果、糖化によって得られたグルコースのδ¹³C値（-27.0±0.1‰）は、原料米（-27.1±0.1‰）および固形残渣（-27.1±0.1‰）と比較して有意差があったが、米麹（-27.0±0.1‰）および蒸米（-27.1±0.1‰）とは有意差はなく、いずれも0.1‰以内の変動であった。さらに、グルコース濃度、分解温度、反応時間は、グルコースのδ¹³C値に有意な影響を及ぼしていなかった。これらの結果は、グルコースのδ¹³C値がずっと維持されていることを示している。グルコースのδ¹³C値は、A. oryzaeによる糖化過程で60%まで分解されても、米のδ¹³C値と一致していた。糖化過程を通してのグルコースのδ¹³C値の持続性は、グルコースのδ¹³C値に基づいた米発酵飲料の原材料判別手法に寄与しうる。
掲載雑誌: Heliyon, 10(13), e33664 (2024)

2 Conversion of polyploid and alloploid Saccharomyces sensu stricto strains to leu2 mutants by genome DNA editing ゲノムDNA編集によるSaccharomyces sensu strictoの倍数体および異質倍体株のleu2変異体への変換

著者

KIYOKAWA Kazuya, SAKUMA Tetsushi, MORIGUCHI Kazuki, SUGIYAMA Minetaka, AKAO Takeshi, YAMAMOTO Takashi, and SUZUKI Katsunori

清川一矢、佐久間哲史、守口和基、杉山峰貴、赤尾健、山本卓、鈴木一周

要旨

A large number of recombinant plasmids for the yeast Saccharomyces cerevisiae have been constructed and accumulated over the past four decades. It is desirable to apply the recombinant plasmid resources to Saccharomyces sensu stricto species group, which contains an increasing number of natural isolate and industrial strains. The application to the group encounters a difficulty. Natural isolates and industrial strains are exclusively prototrophic and polyploid, whereas direct application of most conventional plasmid resources imposes a prerequisite in host yeast strains of an auxotrophic mutation (i.e., leu2) that is rescued by a selection gene (e.g., LEU2) on the recombinant plasmids. To solve the difficulty, we aimed to generate leu2leu2 mutants from yeast strains belonging to the yeast Saccharomyces sensu stricto species group by DNA editing. First, we modified an all-in-one type CRISPR-Cas9 plasmid pML104 by adding an antibiotic-resistance gene and designing guide sequences to target the LEU2 gene and to enable wide application in this yeast group. Then, the resulting CRISPR-Cas9 plasmids were exploited to seven strains belonging to five species of the group, including natural isolate, industrial, and allopolyploid strains. Colonies having the designed mutations in the gene appeared successfully by introducing the plasmids and assisting oligonucleotides to the strains. Most of the plasmids and resultant leu2leu2-mutants produced in this study will be deposited in several repository organizations.

KEY POINTS:

All-in-one type CRISPR-Cas9 plasmids targeting LEU2 gene were designed for broad application to Saccharomyces sensu stricto group species strains.
Application of the plasmids generated leu2 mutants from strains including natural isolates, industrial, and allopolyploid strains.
The easy conversion to leu2 mutants permits free access to recombinant plasmids having a LEU2 gene.

酵母Saccharomyces cerevisiaeの組換え用プラスミドは、過去40年間に数多く構築され、蓄積されてきた。この組換えプラスミドリソースを、自然分離株や工業株が増加しているSaccharomyces sensu stricto群に応用することが望まれているが、これらへの応用には困難が伴う。自然界分離株や工業株は専ら原栄養性で倍数体である。一方、従来のプラスミドリソースのほとんどを直接利用するには、宿主酵母株において、組換えプラスミド上の選択遺伝子（例えば、 LEU2）によってレスキューされる栄養要求性変異（例えば、leu2）が必須条件となる。この難題を解決するため、私たちは、酵母Saccharomyces sensu stricto群に属する酵母株から、DNA編集によりleu2変異体を作製することを目的とした。まず、オールインワンタイプのCRISPR-Cas9プラスミドpML104に抗生物質耐性遺伝子を付加し、 LEU2遺伝子を標的とするガイド配列を設計することで、この酵母グループで広く応用できるように改変した。そして、得られたCRISPR-Cas9プラスミドを5種7株（自然界分離株、工業株、異質倍数体株）に利用した。プラスミドと補助オリゴヌクレオチドを菌株に導入することにより、設計した遺伝子変異を持つコロニーが出現した。本研究で得られたプラスミドおよびleu2変異体の多くは、複数の保存機関に寄託される予定である。

KEY POINTS:

LEU2遺伝子を標的としたオールインワン型CRISPR-Cas9プラスミドは、Saccharomyces sensu stricto株への広範な応用のために設計された。
このプラスミドの応用により、天然分離株、工業株、およびアロポリ倍体株を含む株からleu2変異体が作製された。
leu2変異体への変換が容易であるため、 LEU2遺伝子を有する組換えプラスミドへの自由なアクセスが可能である。

掲載雑誌

Applied Microbiology and Biotechnology, 108, 416 (2024)

3 令和４酒造年度全国新酒鑑評会出品酒の分析について Analysis of sake components presented to the Japan Sake Awards 2023

著者: 磯谷敦子、藤田晃子、赤松史一、岸本徹、ボルジギン・ソリナ、西本真樹、神田涼子、寺本聡子、大串憲祐、福田央

ISOGAI Atsuko, FUJITA Akiko, AKAMATSU Fumikazu, KISHIMOTO Toru, BOERZHIJIN Surina, NISHIMOTO Masaki, KANDA Ryoko, TERAMOTO Satoko, OGUSHI Kensuke, and FUKUDA Hisashi
要旨: 令和４酒造年度全国新酒鑑評会（第111回鑑評会）は、当該年度に日本国内で生産された清酒を全国的に調査研究することにより、製造技術と酒質の現状及び動向を明らかにし、もって清酒の品質及び酒造技術の向上に資するとともに、国民の清酒に対する認識を高めることを目的として、日本酒造組合中央会との共催により実施された。

審査は、酒類総合研究所において、令和５年４月19日（水）から21日（金）の３日間に予審を行い、令和５年５月10日（水）から11日（木）の２日間に決審を行った。また、５月31日（水）から６月１日（木）に東広島運動公園体育館にて製造技術研究会を日本酒造組合中央会との共催で実施するとともに、６月17日（土）に東京池袋のサンシャインシティ・文化会館展示ホールにて日本酒造組合中央会主催の公開きき酒会を共催した。

出品は818点であった。審査の結果、優秀と認められた394点を入賞酒とし、さらに入賞酒の中から決審にて特に優秀と認められた218点に金賞を授与した。また、出品酒を公開する製造技術研究会及び公開きき酒会には、全国からそれぞれ、833人及び1413人が来場した。

出品酒については、審査に加え酒質の現状及び動向を調査研究するため、出品者の記載による「全国新酒鑑評会出品酒調査表」の内容を集計するとともに、成分分析（「老ねやすさ」の受託分析を含む。）を行った。
掲載雑誌: 酒類総合研究所報告, 196, 1-18 (2024)

4 第46回本格焼酎・泡盛鑑評会について Review of the 46th Honkaku Shochu and Awamori Contest in 2023

著者: 向井伸彦、磯谷敦子、奥田将生、髙橋圭、長船行雄、飯塚幸子、福田央

MUKAI Nobuhiko, ISOGAI Atsuko, OKUDA Masaki, TAKAHASHI Kei, OSAFUNE Yukio, IIZUKA Sachiko, and FUKUDA Hisashi
要旨: 単式蒸留焼酎を全国的に調査研究することにより、製造技術と品質の現状及び動向を明らかにし、もって単式蒸留焼酎の製造技術及び品質の向上に資することを目的として、第46回本格焼酎・泡盛鑑評会を独立行政法人酒類総合研究所と日本酒造組合中央会の共催で開催した。

令和５年６月20日（火）及び21日（水）に審査を、７月21日（金）に製造技術研究会を実施した。
　
出品状況、審査及び化学分析結果の概要について報告する。
掲載雑誌: 酒類総合研究所報告, 196, 19-39 (2024)

5 全国地ビール品質審査会2024出品酒の分析について Analysis of beer components presented to craft beer contest of Japan Brewers Association in 2024

著者: 日下一尊、岸本徹、辻井将之、神本真紀、寺本聡子

KUSAKA Kazutaka, KISHIMOTO Toru, TSUJII Masayuki, KAMIMOTO Maki, and TERAMOTO Satoko
要旨: 全国地ビール品質審査会2024は、地ビールの醸造技術向上及び品質改善を目的として、全国地ビール醸造者協議会（Japan Brewers Association）の主催により実施しており、本年で８回目となる。今回は59社から152点の出品があり、品質審査会を令和６年３月６日（水）及び７日（木）に、独立行政法人酒類総合研究所（広島県東広島市）（以下、「研究所」という。）で実施した。出品酒については、令和６年２月から３月の期間において、研究所にて成分分析及び微生物検査を実施したので、その結果について報告する。
掲載雑誌: 酒類総合研究所報告, 196, 40-48 (2024)

6 全国新酒鑑評会及び本格焼酎・泡盛鑑評会で使用するプラスチックカップ（NRIBカップ）の開発 Original plastic cups (NRIB cups) developed for Annual Japan Sake Awards and Honkaku Shochu and Awamori Contest

著者: 岡田佳那子、長船行雄、神本真紀、藤田晃子、高崎京子、神田涼子、寺本聡子、池田優理子、上垣内宏司、仁田英美、伊藤伸一、向井伸彦、山田修、鈴木崇、大串憲祐

OKADA Kanako, OSAFUNE Yukio, KAMIMOTO Maki, FUJITA Akiko, TAKASAKI Kyoko, KANDA Ryoko, TERAMOTO Satoko, IKEDA Yuriko, KAMIGAKIUCHI Hiroshi, NITTA Hidemi, ITO Shinichi, MUKAI Nobuhiko, YAMADA Osamu, SUZUKI Takashi, and OGUSHI Kensuke
掲載雑誌: 酒類総合研究所報告, 196, 49-56 (2024)

1. 第1四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 Spatial distribution and characteristics of protein content and composition in japonica rice grains: implications for sake quality 酒米のタンパク質含有量とタンパク質組成の米粒内空間分布とその特性：予想される清酒品質への影響

著者: TAKAHASHI Kei, KOHNO Hiromi, and OKUDA Masaki

髙橋圭、河野弘美、奥田将生
要約: Background
The quantity and composition of rice proteins play a crucial role in determining taste quality of sake, Japanese rice wine. However, the spatial distribution of proteins within rice grains, especially in endosperm tissue, and the differences between rice varieties remain unclear.
Results
Here, we analyzed the crude protein contents and composition ratios of table (Nipponbare and Koshihikari) and genuine sake rice varieties (Yamadanishiki, Gohyakumangoku, Dewasansan, Dewanosato, and Yumenokaori) to elucidate their spatial distribution within the Japonica rice grain endosperm. Seven sake rice varieties were polished over five harvest years using a brewer’s rice-polishing machine. We obtained fractions at 90%–70% (the outermost endosperm fraction), 70%–50%, 50%–30%, and 30%–0% (the central region of the endosperm fraction). Yamadanishiki and Dewanosato exhibited considerably lower crude protein contents than the other cultivars. After applying SDS-PAGE, the protein composition, comprising glutelin/total protein (G/TP), prolamin/TP (P/TP), and G/P ratios of these fractions was determined. In white rice (at a 90% rice-polishing ratio), the average ratio of the major protein composition was G/TP 41%, P/TP 21%, and G/P ratios of 1.97. Gohyakumangoku and Yamadanishiki had higher G/TP ratio, while Dewanosato had a lower value. Despite having lower crude protein contents, Yamadanishiki and Dewanosato exhibited significantly varying G/TP ratios. The G/TP ratio markedly varied among rice varieties, particularly in the rice grains’ central region. The 50%–30% fraction had the highest P/TP ratio among all tested rice varieties, suggesting spatial differences in P/TP within rice grains. Koshihikari had the lowest P/TP ratio. In addition, the 50%–30% fraction had the lowest G/P ratio among all tested rice varieties, with Gohyakumangoku having the highest G/P ratio. Dewanosato had the lowest G/P value, and this value significantly differed from that of Yamadanishiki in the 30%–0% fraction.
Conclusions
We found substantial differences in protein composition within distinct spatial regions of rice grains, and larger differences among rice varieties were observed in the rice grain's central region.

背景
米タンパク質含量とタンパク質組成は、清酒（日本酒）の味の品質を決定する上で重要な役割を果たしている。しかし、米粒内、特に胚乳組織内のタンパク質の空間分布や米の品種間の違いについては未だ明らかにされていない。
結果
そこで本研究では、一般米（日本晴、コシヒカリ）と酒造好適米（山田錦、五百万石、出羽燦々、出羽の里、夢の香）の粗タンパク質含量と構成比を分析し、酒米（ジャポニカ米）胚乳内におけるそれらの空間分布を明らかにした。醸造用超小型試験精米機を用いて5年間の収穫期間にわたって7品種の酒米を精米し、90%–70%（最外胚乳画分）、70%–50%、50%–30%、及び30%–0%（胚乳の中心領域）の精米歩合別米粉末画分を得た。山田錦と出羽の里は、他の栽培品種と比較して粗タンパク質含量が低かった。SDS-PAGE後、精米歩合別米粉末画分のグルテリン/総タンパク質（G/TP）、プロラミン/総タンパク質（P/TP）及びグルテリン/プロラミン比（G/P）を含むタンパク質組成を解析した。白米（精米歩合90%）における主要タンパク質組成の比率の平均値は、G/TP 41%、P/TP 21%、G/P比は1.97であった。五百万石と山田錦はG/TP比が高く、出羽の里は低かった。山田錦と出羽の里は、粗タンパク質含量が両者同様に低いにもかかわらず、G/TP比には有意な違いが認められた。G/TP比は米の品種間で著しく異なり、特に米粒の中心部で顕著であった。50%-30%画分においては、試験したすべての米品種で最も高いP/TP比を示したことから、P/TP比が米粒内空間で異なっていることが示唆された。主要な食用米であるコシヒカリはP/TP比が最も低かった。また、50%-30%画分においては、試験したすべての米品種でG/P比が最も低く、米品種間の比較においては五百万石のG/P比が最も高かった。出羽の里はG/P値が最も低く、30%-0%画分では山田錦と有意に異なった。
結論
酒米米粒の胚乳組織の中で異なる空間領域内でタンパク質組成に明確な差異があり、米粒の中心部分においては米品種間で大きな違いが認められた。
掲載雑誌: Rice,17, 26 (2024)

2 ビールとスルメの食べ合わせにより感じられる金属臭への寄与成分 (Z)-1,5-octadien-3-one －その分析方法の開発とビールおよび清酒中での濃度変化－ Development of a quantitative analysis method for (Z)-1,5-octadien-3-one: a contributor to the ‘metallic odor' arising from the combination of beer and dried squid, and concentration changes in beer and sake

著者: 岸本徹、久常有里

KISHIMOTO Toru, and HISATSUNE Yuri
要約: アルコール飲料と料理の相性に関する議論では、魚料理と一緒に飲むアルコールの種類によっては、生臭さを感じることがある。しかし、日本酒はこの生臭みを効果的に抑制し、料理との相性を高めることが報告されている。本研究では官能評価を行い、ビールにスルメを合わせると魚由来の金属臭が目立つことを確認した。一方、日本酒とスルメを併用すると、金属臭が効果的に抑制されることが官能評価で確認された。この金属臭の原因物質は、既報の(Z)-1,5-オクタジエン-3-オンと同定された。アルコール飲料中の(Z)-1,5-オクタジエン-3-オンの1ng/L(ppt)以下の定量分析を行った。SBSE抽出、PFBOA誘導体化、NCIイオン化、GC/MS/MS分析を組み合わせた高感度で合理的な定量法を確立した。日本酒、ビール、スルメを混合した場合の(Z)-1,5-オクタジエン-3-オンの生成量を測定したところ、日本酒の方が有意にレベルが低く、平均生成量はビールより7.1倍低かった。本研究は、清酒の生臭さの一因とされる「金属臭」の抑制を成分レベルで初めて実証し、「食品との相性」についての知見を提供するものである。

In discussions on the compatibility of alcoholic beverages with food, certain types of alcohol consumed with fish dishes may impart a fishy odor. However, sake has been reported to effectively suppress this odor, enhanciing its compatibility with food. This study conducted sensory evaluations, confirming that when beer was paired with dried squid (Surume), a fish-derived metallic odor was noticeable. In contrast, when sake was combined with Surume, the metallic odor was effectively suppressed, as confirmed by sensory assessments. The contributing substance to this metallic odor was identified as the previously reported (Z)-1,5-octadien-3-one. A quantitative analysis of (Z)-1,5-octadien-3-one at levels below 1 ng/L (ppt) in alcoholic beverages was conducted. A highly sensitive and streamlined quantitative method was established, combining SBSE extraction, PFBOA derivatization, NCI ionization, and GC/MS/MS analysis. Measurement of (Z)-1,5-octadien-3-one production when mixing sake, beer, and Surume revealed significantly lower levels in sake, with an average generation rate 7.1 times lower than that in beer. This study demonstrates -- for the first time from a component perspective -- the inhibition of the ‛metallic odor', considered a factor contributing to the fishy odor in sake, providing insights into the ‛compatibility with food' at a component level.
掲載雑誌: 日本醸造協会誌, 119(5), 257-266 (2024)

3 Effect of S-adenosyl-methionine accumulation on hineka odor in sake brewed with a non-Kyokai yeast 非協会系酵母で製造した清酒の老香に対するS-アデノシルメチオニン蓄積の効果

著者: SHIBATA Yusuke, YAMADA Tasuku, IKEDA Yuriko, KANAI Muneyoshi, FUJII Tsutomu, AKAO Takeshi, GOSHIMA Tetsuya, ISOGAI Atsuko, and TAKAHASHI Toshinari

柴田裕介、山田翼、池田優理子、金井宗良、藤井力、赤尾健、五島徹也、磯谷敦子、高橋俊成
要約: Hineka is a type of off-flavor of sake and is attributed to the presence of several compounds, including a major one called dimethyl trisulfide (DMTS). The production of the main precursor of DMTS involves yeast methionine salvage pathway. The DMTS-producing potential (DMTS-pp) of sake brewed using the Km67 strain, a non-Kyokai sake yeast, is lower than that of sake brewed using Kyokai yeast; however, the detailed mechanism is unclear. We focused on S-adenosyl-methionine (SAM) and aimed to elucidate the mechanism that prevents DMTS production in sake brewed using the Km67 strain. We revealed that SAM is involved in DMTS production in sake, and that the conversion of SAM to the DMTS precursor occurs through an enzymatic reaction rather than a chemical reaction. Based on previous reports on ADO1 and MDE1 genes, sake brewing tests were performed using the Km67 Δmde1, Δado1, and Δmde1Δado1 strains. A comparison of the SAM content of pressed sake cakes and DMTS-pp of sake produced using the Km67 Δado1 strain showed an increase in both SAM content and DMTS-pp compared to those produced using the parent strain. However, the Km67 Δmde1Δado1 strain showed little increase in DMTS-pp compared to the Km67 Δmde1 strain, despite an increase in SAM content. These results suggest that SAM accumulation in yeast plays a role in the production of DMTS in sake through the methionine salvage pathway. Moreover, the low SAM-accumulation characteristic of the Km67 strain contributes to low DMTS production in sake.

DMTSの主な前駆体は酵母のメチオニンサルベージ経路に関与している。非清酒酵母であるKm67株を用いた清酒のDMTS産生能（DMTS-pp）は、協会酵母を用いた清酒よりも低いが、その詳細なメカニズムは不明である。我々はS-アデノシルメチオニン（SAM）に着目し、Km67株を用いた清酒のDMTS生成抑制メカニズムの解明を目指した。その結果、SAMが清酒中のDMTS生成に関与していること、SAMからDMTS前駆体への変換は化学反応ではなく酵素反応によって起こることを明らかにした。ADO1およびMDE1遺伝子に関する既報に基づき、Km67のΔmde1、Δado1およびΔmde1Δado1株を用いて清酒醸造試験を行った。Km67 Δado1株を用いて製造した清酒の搾り粕中のSAM含量およびDMTS-ppを比較したところ、親株を用いて製造した清酒と比較して、SAM含量およびDMTS-ppともに増加していた。しかし、Km67 Δmde1Δado1株は、Km67 Δmde1株に比べ、SAM含量は増加したものの、DMTS-ppはほとんど増加しなかった。これらの結果は、酵母におけるSAMの蓄積が、メチオニンサルベージ経路を介した清酒中のDMTS産生に関与していることを示唆している。さらに、Km67株の特徴であるSAM蓄積量の低さは、清酒のDMTS生産量の低さに寄与している。
掲載雑誌: Journal of Bioscience and Bioengineering, 137, 268-273 (2024)